LABORWELT. Biochip-Technologie. Special Custom Chips & Oligo-Service. Marktübersicht. Microarray- Reader. Ultrasensitive Protein- und DNA-Chips

LABORWELT III/2002

Das Themenheft von


Special Custom Chips & Oligo-Service
Marktübersicht MicroarrayReader

Biochip-Technologie
Ultrasensitive Protein- und DNA-Chips
Komplexe Peptidarrays auf Computerchips
Nanopumpen für schnellere MicroarrayInkubation
Chipanalyse zellulärer Ionenkanäle

BIOCOM AG

Bildmaterial: MWG Biotech; Fotomontage: Heiko Fritz


Vorschau: die neue MatriXarrayPlattform von Roche

I

N

T

R

O


Zum Thema

Microarrays: höher, schneller, weiter… Nach den DNA-Chips sind jetzt die Protein- und Antikörper-Arrays an der Reihe. Die US-Unternehmensberatung Frost & Sullivan prognostiziert in ihrer jüngsten Studie „Proteinarrays vor dem Boom“, daß binnen nur fünf Jahren der noch junge Markt für die Analyse-Chips von derzeit 41,2 Mio. US-$ auf mehr als 665 Mio. US-$ „explodieren“ wird. Die Technologieanbieter nehmen mit neuen Produkten schon jetzt den jungen Markttrend spürbar auf. Und auch in der Wissenschaft regt sich einiges: Seit Juni etwa liegt in Brüssel ein Wunschzettel deutscher Proteomforscher, die den Aufbau der bislang umfassendsten Sammlung menschlicher Proteine und Antikörper gerne zur Hälfte aus dem 6. EU-Forschungsrahmenprogramm finanziert hätten – die Sammlung dieser „European Protein Initiative“ (EPI) könnte zum Beispiel die Diagnose und Erkennung krankheitsassoziierter Muster mit Antikörper-Chips voranbringen. Mit der vorliegenden Ausgabe versuchen wir, den neuen Trend mit aktuellen Beiträgen aus Wissenschaft und Unternehmen aufzugreifen und – in Ausschnitten – abzubilden (s. Seiten 20, 24, 30 und 44). Doch auch auf anderen Feldern der Chiptechnologie geht es voran. Wissenschaftler vom Center for Nano Science der LMU München etwa stellten diesen Sommer eine Chiptechnologie vor, mit der zelluläre Ionenkanäle untersucht werden können (siehe S. 16). Eine Gruppe um die DKFZ-Forscherin Annemarie Poustka hat ein neues Verfahren entwickelt, um in Feststoffe eingebettete aktivierte Aminosäuren auf Arrays zu bringen – und zwecks Vermarktung des flüssigkeitsfreien Verfahrens eine Firma gegründet (siehe S. 4). Und Diagnostik-Gigant Roche Diagnostics gewährt bereits in dieser Ausgabe erste Einblicke in seine neue Microarray-Plattform (siehe S. 8), bevor die Vermarktung im nächsten Jahr startet.

Inhalt BLITZLICHT

4 Hochkomplexe Peptidarrays auf Computerchips ANNEMARIE POUSTKA ET AL., DKFZ HEIDELBERG BLITZLICHT The matriXarray platform – a novel and flexible approach for gene analysis HORST DONNER ET AL., ROCHE DIAGNOSTICS, PENZBERG

8

BLITZLICHT

12 Nanopumpen verbessern die Microarray-Inkubation JÜRGEN SCRIBA ET AL., ADVALYTIX, BRUNNTHAL BLITZLICHT

16 Biochip für die Untersuchung zellulärer Ionenkanäle NIELS FERTIG, JAN C. BEHRENS ET AL. NANION TECHNOLOGIES, CENS, MÜNCHEN BLITZLICHT Neue Protein-Arrays und 20 Zytokin-Detektions-Chips JENS BEATOR, SCHLEICHER&SCHUELL, DASSEL

REPORT

24 Proteinarrays – Tools für Proteomics und Diagnostik Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service: online unter www.biocom.de oder auf dem beiliegenden Fax-Formular Wenn Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer ankreuzen, Name und Adresse angeben und faxen/mailen – Sie erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten.

THOMAS JOOS ET AL., NMI, REUTLINGEN BLITZLICHT

30 Protein Chip® System ANDREAS WIESNER ET AL., CHIPERGEN, GÖTTINGEN MARKTÜBERSICHT

Trotz aller Begeisterung für die Parallelisierung und den hohen Durchsatz, der mit „Bio-Chips“ machbar ist, hat die noch junge Technologie natürlich auch ihre grundsätzlichen (in vitro-Technik!) und spezielleren Probleme. Eines davon lautet Standardisierung (siehe S. 35) der mit den unterschiedlichen Auslesegeräten (Marktübersicht S. 32) gewonnenen Daten, ein anderes ist die Frage, ob man selbst teuere Geräte kaufen soll oder andere die Chips herstellen läßt. Lesen Sie dazu ein kleines Special Oligonukleotid-Service und Custom-Arrays (siehe die Beiträge auf S. 38 ff. und 41ff.). Am Ende noch eine Vorab-Information in eigener Sache: Mit der nächsten Ausgabe wechselt die Chefredaktion der Zeitschrift LABORWELT. Künftig wird Frau Andrea Schneider, bestens bekannt durch ihre langjährige Arbeit für ein rennomiertes Life-Sciences-Magazin, von Martinsried aus die Entwicklung von LABORWELT steuern. Wir freuen uns über die Verstärkung unseres Teams. Viel Spaß beim Lesen wünscht Ihnen

32 Microarray-Reader BLITZLICHT

35 Standardisierung von Microarray-Experimenten KARIN ADELHELM, EUGEN EHRMANNTRAUT, CLONDIAG CT, JENA SPECIAL Custom-Chips & 38, 41 Oligonukleotid-Service  MICHAEL GISMANN ET AL., GENESCAN GRUPPE, FREIBURG;  LUTZ WEHMEIER ET AL., MWG BIOTECH, EBERSBERG BLITZLICHT

43 Hochdurchsatz-PCR: vom Genom zum Expressionsprofil PATRICIA LANGER ET AL., GATC, KONSTANZ REPORT

Ihr LABORWELT-Team

44 Ultrasensitive DNA- und Proteinarrays MICHAEL PAWLAK ET AL., ZEPTOSENS, WITTERSWIL, CH

 Information ordern?  Kennziffer 11 LW 03 / www.biocom.de |transkript LABORWELT

49 Produktwelt, Impressum

Nr. III/2002 | 3

B

L

I

T

Z

L

I

C


Proteomics

Dr. Frank Breitling1, Dipl.-Ing. Frieder Breitling2, Dr. Thomas Felgenhauer3, Dr. Simon Fernandez1, Dipl.-Ing. Klaus Leibe3, Dipl.-Chem. Mario Beyer1, Dr. Volker Stadler1, PD Dr. F. Ralf Bischoff3, Prof. Dr. Annemarie Poustka1 Deutsches Krebsforschungszentrum,1Abteilung Molekulare Genomanalyse, 2PEPperPRINT GmbH, 3 Abteilung Molekulare Biologie der Mitose Ziel unserer Forschungsarbeiten ist die Entwicklung hochkomplexer Peptidarrays für die biomedizinische Forschung. Die Grundlage dafür bildet ein Verfahren zur kombinatorischen Peptidsynthese auf einem Computerchip, der die Erzeugung unterschiedlicher Ladungsmuster auf der Oberfläche ermöglicht. Dazu werden die 20 verschiedenen biogenen Aminosäuren jeweils in unterschiedliche Partikel eingeschlossen und durch elektrostatische Kräfte nacheinander an die Syntheseorte auf dem Chip angelagert. Die Partikel bestehen aus einem bei Raumtemperatur festen Lösungsmittel (z.B. Diphenylformamid), in das die Fmoc-Aminosäuren eingebettet sind. Durch Erwärmung schmelzen die Partikel auf dem Chip und die eingeschlossenen Aminosäuren werden für die Kopplung freigesetzt. Durch wiederholtes Anlagern und Koppeln der Aminosäuren kann eine große Zahl unterschiedlicher Peptide simultan auf dem Chip synthetisiert werden.

Viele Infektionskrankheiten (z.B. Borreliose, Tuberkulose) zeigen je nach Patient einen sehr unterschiedlichen Verlauf. Während in einigen Fällen nicht einmal bemerkt wird, daß eine Infektion stattgefunden hat, können in anderen Fällen schwerste Komplikationen auftreten. Ein vieldiskutierter Einflußfaktor dabei ist der sogenannte Immunstatus des Patienten. Aus diesem GrundeAerscheint es interessant, die Antikörperprofile von Patientengruppen mit unterschiedlicher Ausprägung der Krankheit zu vergleichen. Mit sogenannten Peptidomarrays® könnte die Gesamtheit aller Proteine (z.B. von Borrelia burgdorferi) in Form überlappender Peptide auf einem einzigen Peptidarray repräsentiert werden. Der dafür benötigte Array mit etwa 150.000 Peptiden des Erregers (die überlappenden Peptide sind dabei jeweils um fünf Aminosäuren gegeneinander versetzt) könnte einen möglichst umfassenden Nachweis von Borrelia burgdorferi-spezifischen Antikörpern

Abb. 1: Kombinatorische Peptidsynthese mit Hilfe von Aminosäure-Partikeln 4 | Nr. III/2002

T Kennziffer 12 LW 03
Info ordern?


Hochkomplexe Peptidarrays auf Computerchips

Analyse des Immunstatus durch Peptidom-Arrays

H

im Blut infizierter Patienten ermöglichen. Derartige Antikörperprofile eröffnen die Differentialdiagnose von Krankheitsbildern. Ähnliches gilt für Peptidomarrays anderer Spezies, wie Mycobacter tuberculosum (ca. 200.000 Peptide benötigt) oder Plasmodium falciparum (ca. 500.000 Peptide benötigt).

Verfügbare Peptidarrays Die Pionierarbeit auf dem Gebiet der Peptidarrays kann Prof. Dr. Ronald Frank (GBF Braunschweig) zugeschrieben werden 1,2. Trotz großer Anstrengungen in den letzten Jahren weisen die derzeit verfügbaren Peptidarrays aber noch wesentlich weniger Oligomere pro Flächeneinheit auf als die Standardprodukte im Bereich der hochkomplexen Oligonukleotid-Arrays. Mit den zur Zeit verfügbaren Techniken können zwischen 10.000 und 50.000 unterschiedliche Peptide auf einem Träger von ca. 20 cm x 20 cm hergestellt werden 3,4. Eine Hauptschwierigkeit aller Spot-Techniken – nur diese liefern derzeit brauchbare Resultate – ist die Handhabung winzigster Flüssigkeitsmengen. Die auf den Träger aufgebrachten Tröpfchen variieren in ihrer Größe und das Lösungsmittel verdunstet oder verbreitet sich auf dem Träger. Darüber hinaus sind uneinheitliche Kopplungsbedingungen ein Problem, da die zuerst aufgebrachten Monomere bereits an den Träger koppeln, während an anderer Stelle noch gedruckt wird. Um wesentlich komplexere Peptidarrays herstellen zu können, ist es daher erforderlich, ein neues Verfahren zu entwickeln.

Kombinatorische Peptidsynthese mit einem Laserdrucker Diese Probleme können mit trockenen Aminosäure-Partikeln umgangen werden, die den Kern des hier vorgestellten, neuen Verfahrens bilden. In die Matrixsubstanz dieser Partikel (z.B. Diphenylformamid, Diphenylsulfoxid)

1

2

3

Abb. 2: Blaue Bereiche weisen durch Bromphenolblau gefärbte freie Aminogruppen von gekoppeltem Alanin nach. Individuell nachweisbar sind 18 (1), 46 (2) und 184 (3) Spots/cm2 . Zunächst wurden die Fmoc-Alanin-Partikel mit Hilfe eines Laserdruckers positioniert, anschließend das darin eingeschlossene Fmoc-Alanin an den Träger gekoppelt und freie Aminogruppen durch Essigsäureanhydrid blockiert. Nach der Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe wurden die neuentstandenen, freien Aminogruppen mit Bromphenolblau nachgewiesen.

sind die Monomere (z.B. Fmoc-geschützte Aminosäurecarboxyanhydride) eingeschlossen (Abb. 1.1). Die Matrixsubstanz der Partikel ist bei Raumtemperatur fest, so daß sie sich wie normale Tonerpartikel mit einem Farblaserdrucker an exakt definierbare Orte auf einem zweidimensionalen Träger drucken lassen. Jeweils nach dem Aufbringen einer vollständigen Druckschicht von unterschiedlichen Aminosäuren-Tonerpartikel werden die in diesen Partikeln immobilisierten Monomere durch einen wärmeinduzierten Phasenwechsel von fest nach flüssig aus den Tonerpartikeln freigesetzt (Abb. 1.2). Unter diesen Bedingungen erfolgt die Kopplung der Monomere an den Träger oder an die bereits synthetisierten Oligomerketten. Danach werden ungebundene Monomere weggewaschen (Abb. 1.3) und anschließend die Fmoc-Schutzgruppe abgespalten. Erste Ergebnisse sind in Abbildung 2 (siehe Seite 6) gezeigt. Zu sehen ist ein Ausschnitt von 18 cm–2 (oben), 46 cm–2 (links) bzw. 184 cm–2 (Mitte) blau angefärbter, optisch auflösbarer Aminosäure-Spots. Die Aminosäuren |transkript LABORWELT

B

L

I

T

Z

L

I

C

Abb. 3: Vergleich von normalem Hewlett Packard Farbtoner (blau; ca. 5 µm) mit Aminosäure-Partikeln, die mit einer Luftstrahlmühle hergestellt wurden.

wurden mit Hilfe eines Laserdruckers auf dem Träger positioniert und gekoppelt. Abbildung 3 zeigt die dafür verwendeten Aminosäuren-Partikel im Vergleich zu handelsüblichem Farbtoner. Ein Laserdrucker, der in der Lage ist, mehrere Schichten exakt übereinander zu drucken und damit den Aufbau von Peptiden aus einzelnen Aminosäuren erlaubt, wird zur Zeit am Fraunhofer-Institut für Produktionstechnik und Automatisierung in Stuttgart konstruiert und steht voraussichtlich Anfang 2003 zur Verfügung. Das entscheidend neue an diesem Verfahren sind die Aminosäure-Partikel, deren Matrixmaterial zum Lösungsmittel für eine chemische Synthese umgewandelt werden kann. Bei allen bisher bekannten Methoden zur Herstellung von Arrays werden die Monomere in Flüssigkeiten auf den Träger aufgebracht. Bei dem hier beschriebenen Verfahren geschieht dies in Form der beschriebenen trockenen Aminosäuren-Tonerpartikel5 . Abbildung 4 zeigt den Vergleich zwischen der von Frank et al. entwickelten SPOT-Synthese2 und der Verwendung trockener Aminosäuren-Partikel. Beide Verfahren beruhen im Prinzip auf dem seit fast 40 Jahren bewährten Peptidsyntheseverfahren nach Merrifield6 mit dem Unterschied, daß bei den

H

T PEPperPRINT

Dieser einfache Ansatz wird aller Voraussicht nach zu einem Patent führen, das ein neuartiges Verfahren zur Array-Herstellung breit abdeckt5. Auf der Grundlage dieser Patentanmeldung wurde im März vorigen Jahres die PEPperPRINT GmbH aus dem DKFZ ausgegründet. Das junge Unternehmen sucht derzeit nach Investoren. Die PEPperPRINTTechnologie zählte im vergangen Jahr zu den Gewinnern des Businessplanwettbewerbs „Genius Biotech Award“ und des Innovationswettbewerbs zur Förderung der Medizintechnik. Letzterer wird vom Bundesministerium für Bildung und Forschung „für besonders innovative und originelle Forschungsideen im Bereich der Medizintechnik“ vergeben.

Aminosäure-Tonerpartikeln statt Dimethylformamid das chemisch sehr ähnliche Diphenylformamid verwendet wird.

PEPperChip Beim PEPperChip soll anstelle eines Laserdruckers ein weitestgehend handelsüblicher Computerchip mit derzeit mehr als 100 Millionen individuell ansteuerbaren Orten (pro cm2) zum Positionieren der Partikel verwendet werden. Auf diesem Chip kann direkt ein Muster elektrostatischer Ladungen erzeugt werden, wodurch gleichartig geladene Partikel an die ungeladenen Orte durch Induktion einer Bildladung binden können (Abb. 5). Diese Anlagerung – verbunden mit einem kurzen Anschmelzen – kann für jede Art von Partikel nacheinander ausgeführt werden, ohne daß eine chemische Reaktion eingeleitet werden muß. Erst nachdem alle Partikelsorten positioniert sind, erfolgt die gleichzeitige Kopplung aller Aminosäuren (z.B. durch vollständiges Schmelzen und Aktivierung einer in den Partikeln zusätzlich eingeschlossenen Photobase). Daher erwarten wir, daß mit Hilfe dieser Technik in absehbarer Zeit hochkomplexe und vergleichsweise kostengünstige Peptidarrays zur Verfügung stehen werden.

Abb. 5: Beladung des Chips mit AminosäurePartikeln durch selektive elektrische Aufladung

Literatur 1. Frank R (1992) An easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron 48, 9217-9232 2. Frank R, Overwin H (1996) SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol 66, 149-169 3. Chan WC, White PD (Editoren) (2000) Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis; Kapitel 14. 346 Seiten. Oxford University Press, ISBN 0-19-963 724 5 4. www.jerini.de 5. Breitling, F., Poustka, A., Groß, K.H., Dübel, S. und Saffrich, R. (1999). Verfahren und Vorrichtungen zum Aufbringen von Substanzen auf einen Träger, insbesondere von Monomeren für die kombinatorische Synthese von Molekülbibliotheken. Deutsche Patentanmeldung DE19960346, europäische Patentanmeldung EP1140977A2, amerikanische Patentanmeldung US880688. 6. Merrifield RB, Stewart JM (1965) Automated peptide synthesis. Nature 207, 522-523

Korrespondenzadresse

Abb. 4: Der Unterschied zwischen dem PEPperPRINT-Verfahren und der Spot-Synthese ist das verwendete „feste“ Lösungsmittel und der wärmeinduzierte Phasenwechsel der Aminosäure-Partikel von fest nach flüssig. 6 | Nr. III/2002

Dr. Frank Breitling Deutsches Krebsforschungszentrum Im Neuenheimer Feld 280 Abteilung Molekulare Genomanalyse Tel.: 06221-42 4747 Fax: 06221-42 3454 eMail: [email protected]

Kennziffer 13 LW 03
Info ordern?
|transkript LABORWELT

B

L

I

T

Z

L

I

C

H

T


Roche Applied Science

The matriXarray platform: a novel and flexible approach for gene analysis Horst Donner, Uschi Brehm, Jochen Hurlebaus, Jochen Renzing, Angelika Roesler and Bruno Frey, Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Penzberg, Germany The parallel investigation of hundreds to thousands of different genes by DNA microarray analysis has shifted the focus of many researchers from a genetic to a genomic level. Based on the four-letter code, genomic information is available as DNA (genome) or RNA (transcriptome) in living cells. Whilst RNA as the mediator between genomic information and gene function is used to monitor the expression of genes, DNA as the mediator between the genomic information of different generations is used to screen for mutations among different individuals and populations. Microarrays in general are composed of a two or three-dimensional solid surface where DNA used as capture molecule (probe) is attached. Many spots are distributed over the surface in an arranged fashion containing a specific probe sequence. Each of the sequences corresponds to a specific target sequence enabling the researcher to measure hybridization of thousands of different sequences in parallel. The formation of the probe sequences varies among different microarray platforms. Whereas cDNA microarrays are composed of amplified double-stranded DNA fragments (several 100 bp of length); oligonucleotide arrays are utilizing single-stranded DNA molecules (varying from 20 up to 80 bp in length). These oligonucleotides can be synthesized ex-situ and are then automatically printed onto the surface, or can be synthesized on the array. The production method of microarrays is essential for reproducibility and reliability of the experiments. Whereas the standardized and reproducible cultivation and amplification of bacterial DNA clones is difficult to achieve, the synthesis of oligonucleotides could be more easily embedded into an industrial workflow including several quality control steps. Oligonucleotide microarray platforms also offer more flexibility, especially when probe synthesis can be addressed individually for each spot on each array. This flexibility can only be achieved by utilizing an on chip synthesis principle.

matriXarray: new technology for chip design and production A maximal flexibility provided by the matriXarray platform from Roche Applied Science is based on the in-situ synthesis of DNA on semiconductor integrated circuits as well as the virtual flask technology. Figure 1 shows a 6-inch silicon wafer, that forms the basal surface of the array. A porous reaction layer is applied on one side of the semiconductor surface in order to enhance sur-

face area. The three-dimensional array surface is covered by a disposable housing including an inlet and outlet. Oligonucleotide synthesis is performed utilizing phosphoramidite chemistry and electrochemical deprotection. This electrochemical deprotection is controlled individually for each spot on each array leading to a maximum flexibility within and between arrays. Virtual flask technology prevents the diffusion of the reaction compounds in order to

Fig. 1: Array fabrication for on-chip synthesis. Top left: a wafer containing many microarrays; middle: single matriXarray in a rectangular format; lower right: small section of the matriXarray showing individually addressable electrodes and their associated circuits. 8 | Nr. III/2002

Fig. 2: Virtual flask technology. Three electrodes are turned on while the other electrodes remain off. Electrochemically generated acids from active electrodes enable the specific coupling of the next nucleotide by de-protection via H+ ions. Hereby coupling efficiency is greater 98% allowing oligonucleotide synthesis of more than 25 bp in length.

avoid contamination of surrounding electrodes. So far, up to 1000 features could be synthesized individually per array (figure 2). The first essential step in planning an microarray-experiment is careful selection of capture probe sequences. For optimal performance these oligonucleotides should have similar melting temperatures, avoid secondary structures and should be checked for crosshybridization within the pool of target sequences. In RNA-profiling this pool of target sequences is not 100% characterized even for human applications. Additionally, the huge number of unknown splice variants necessitates the ability to rapidly iterate microarray designs. With the matriXarray system of Roche Applied Science, a complete workflow for convenient on-line design, ordering and delivery of customized microarrays will be made available.

Optimized kits for target preparation Target preparation is related to the starting amount and platform used in the experiment. Kits and reagents have been developed by Roche Applied Science for direct labeling of targets during cDNA synthesis as well as target amplification. For the application of the matriXarray platform incorporation of labeled nucleotides during T7 amplification (Eberwine protocol) is recommended. According to the amount of starting material, a method for PCR amplification prior to the T7 amplification has been developed. Consequently labeled targets can be generated from as little as 50 ng of total RNA.

Kennziffer 14 LW 03
Info ordern?
|transkript LABORWELT

B

L

I

T

Z

L

I

C

workflow is fully automated in order to enhance reproducibility of the results.

Applications Today expression-profiling as well as mutation analyses are the two main applications for microarray analysis. Two examples for both applications are the evaluation of expression profiles from rat tissues as well as the analysis of mutations within the cystic fibrosis transmembrane conductor (CFTR) gene.

Fig. 3: Image overlay of a co-hybridization experiment utilizing rat liver and brain tissues. 24 spots out of a 1 k array co-hybridization experiment show the expression of tissue-specific and tissue-independent genes. Spots coloured red indicate liver specific, those coloured green indicate brain specific cDNA. Yellow spots show simultaneous expression in both tissue types. Gene names corresponding to the probes within the numbered spots are listed below: 1. fatty acid binding protein 1, fabp1: specific for liver; 2. creatine kinase: specific for brain 3. alpha-tubulin: housekeeping-gene expressed in liver and brain 4. acidic calcium-independent phospholipase A2: housekeeping-gene expressed in liver and brain

Comparison of expression profiles derived from various rat tissues By using inbred rat strains for tissue comparison (e.g. liver, kidney, heart etc.), a variation based on the genetic background is minimized. Set up experiments are focused on genes displaying an ON/OFF mode based on the specific physiological function of each organ. Distinct expression of those genes together with so-called house keeping genes are shown in figure 3. Differences of gene expression within a tissue or between several tissues can be further calculated by a data analysis software. This software enables the researcher to evaluate ratios as well as to perform hierarchical clustering. Mutation analysis within the CFTR gene

Fully automated hybridization and image acquisition For hybridization and subsequent reading of the chips only arrays, targets and buffer components have to be inserted into to the matriXarray hybridizing and imaging instrument. A pipetting robot performs liquid handling and image acquisition is done by CCD camera. A complete experimental workflow for 6 different arrays can be completed in less than 6 hours. Image analysis is performed at the same workstation utilizing proprietary software tools. The hybridization

Cystic fibrosis is the most common, early lethal genetic disease within Caucasians. Whilst more than one thousand mutations are described so far, only a few of them are responsible for nearly 99% of aberrant transcripts. Since these mutations include single or dinucleotide insertions and deletions as well as single base pair substitutions the CFTR gene serves as a suitable target for microarray analysis. Typical results are shown in figure 4. For gene expression as well as mutation analysis several alternative methods are availab-

Fig. 4: Mutation detection within the cystic fibrosis (CFTR) gene. A labeled fifteen-plex PCR reaction covering more than 30 polymorphic sites within the CFTR gene was hybridized onto a matriXarray chip. As an example, three probes for the wild type sequence (corresponding to three polymorphic sites) as well as three corresponding nucleotide substitutions are displayed. As the sample was extracted from a healthy individual, only probes corresponding to the wild type (WT, indicated in blue) produce positive signals. 10 | Nr. III/2002

H

T

le (e.g. RT-PCR, Northern Blots, RFLP, etc.). The key advantage of microarray experiments is the parallelization of hybridization experiments. Although these parameters differ between expression profiling and mutation detection, parallelization requires optimal hybridization conditions as well as probe sequences for hundreds or thousands of genes or polymorphic sites within the same experiment. Since assay optimization could not be achieved in a single-step approach, flexibility is one of the key features of the matriXarray System of Roche Applied Science.

Summary Array technology is delivering new information about complex interactions at a molecular level. This knowledge will be reshaping the ways how research will be conducted in the future. Especially in respect to complex human diseases microarray analysis is expected to deliver fundamental insight in pathogenic processes. It might help therefore to increase the prognostic and therapeutic capabilities of medical treatments in the future. By utilizing the matriXarray platform developed by Roche Applied Science, researchers are now able to address the rapidly increasing amount of new data more flexible, within their array experiment. This includes change of probe sequences, gene lists as well as the switch between organisms and applications. Furthermore, together with optimized kits and reagents the matriXarray platform offers superior solutions for the complete workflow of an array experiment. This might be of great importance especially when protocols and/or data should be exchanged between different labs. Together with MagNA Pure LC and the LightCycler System the matriXarray platform expands the portfolio of automated systems for nucleic acid analysis of Roche Applied Science. Especially the interaction between these different platforms might help to speed up research and development in the future. A first impression of the matriXarray platform could be received at the MEDICA in November 2002 although launch of the system will be during the year 2003.

Correspondence Horst Donner, PhD Roche Applied Science Roche Diagnostics GmbH/House 241, Room 379 Nonnenwald 2 D-82372 Penzberg Tel: 08856-60 3901 Fax: 08856-60 3156 eMail: [email protected]

Kennziffer 15 LW 03
Info ordern?
|transkript LABORWELT

B

L

I

T

Z

L

I

C


Microarrays

Nanopumpen verbessern die Microarray-Inkubation Dr. Jürgen Scriba, Andreas Tögl, Dr. Roland Kirchner, Advalytix AG, Brunnthal Mit einer neuartigen Technologie gelingt es, die Probenflüssigkeit während der Inkubation von Microarrays im Kapillarspalt ohne zusätzliche Totvolumina effektiv zu durchmischen. Die Durchmischung erhöht die Signalintensität, verkürzt die Inkubationszeiten und ermöglicht die in-situ-Messung der Reaktionskinetik. DNA- und Protein-Microarrays spielen in vielen Bereichen der biologischen Forschung eine immer wichtigere Rolle. Ihr geringer Probenverbrauch und die hohe Parallelität der Assays machen sie zu einer Schlüsseltechnologie im Hochdurchsatz-Screening. Hochdichte Chips ermöglichen die Expressionsanalyse eines vollständigen Genoms in einem Experiment. Für viele Anwendungen von der routinemäßigen Nahrungsmittelanalyse bis zur Genexpressionsanalyse stehen kommerzielle Chips zur Verfügung. Die zahlreichen am Markt erhältlichen Spotter- und Readersysteme, spezielle Slides mit optimierten Oberflächen und hochwertige Verbrauchsmaterialien machen Microarray-basierte Assays zu einem Standard in vielen

Abb.1: AdvacardTM mit drei Mischerchips, Funktionsprinzip der auf dem Chip integrierten Nanopumpen, die mit Hilfe von Oberflächenwellen Strömungen in Flüssigkeiten anregen. 12 | Nr. III/2002

H

T

Betrachtet man die Situation eines Microarrays im Maßstab 1 zu 1000, wird das Problem intuitiv klar: Auf einem Slide von der Größe eines Fußballplatzes stünde die Probenlösung etwa knöcheltief. Die Spots sind in diesem Bild etwa handtellergroß. Daß während endlicher Inkubationszeiten DNA-Moleküle aus der rechten Spielfeldhälfte den passenden Spot auf dem linken Elfmeterpunkt finden, ist praktisch ausgeschlossen, da sie durch Diffusion während eines Tages in diesem Maßstab nur einige Meter überwinden können. Moleküle außerhalb dieses Radius tragen nicht zum Signal eines Spots bei. Abhän-

Abb. 2: Verteilung von Farbstoff im Kapillarspalt über einem Objektträger in 15 Minuten. Oben: Bei Durchmischung mit SAW-Nanopumpen, unten: ohne Durchmischung

Labors. Gleichwohl läßt ein zentraler Bereich der Microarray-Technologie nach wie vor breiten Raum für eine Optimierung: Die spezifische Bindung zwischen Target-Molekülen in der Probenflüssigkeit und den an der Slideoberfläche immobilisierten Fängermolekülen findet in einer äußerst ungünstigen Geometrie statt. Da im Kapillarspalt zwischen Slide und Deckglas ohne zusätzliche Maßnahmen die Durchmischung auf Diffusion beschränkt ist, kommt es in der unmittelbaren Nachbarschaft der Fängermoleküle zu Verarmungszonen, die nur durch Diffusion ausgeglichen werden können. Die Folge sind lange Inkubationszeiten, Inhomogenitäten auf dem Array und ein nicht optimales Signal-Rausch-Verhältnis. So trivial sich das Problem der Durchmischung auf makroskopischer Ebene darstellt, so hartnäckig entzieht es sich der mikrofluidischen Lösung. Einerseits fehlte bislang das mikromechanische Pendant zum Magnetrührer, der im Kapillarspalt mit einer Höhe von nur 0,1mm eingesetzt werden könnte. Andererseits verhindert die geringe Dicke des Flüssigkeitsfilms die Bildung von Turbulenzen. Deshalb können Inkubationssysteme, die mit Hilfe externer Pumpen versuchen, die Probenlösung im Kapillarspalt zu durchmischen, bestenfalls laminare Strömungen im Spalt erzeugen. Da laminare Strömungsfäden jedoch per se stationär sind, ist eine flächige Durchmischung ausgeschlossen. Die zur Befüllung externer fluidischer Systeme nötigen Zusatzvolumina und die damit verbundene Verdünnung der Probe – zum Teil um Faktoren – kann zudem einen möglichen positiven Effekt auf die Reaktionskinetik und das Reaktionsgleichgewicht zunichte machen.

gig von der relativen Konzentration der verschiedenen Bindungspartner können manche Spots daher nicht die maximale Intensität erreichen, es kommt zur lokalen Verarmung. Fehlende Durchmischung ist zudem vermutlich auch für Beeinträchtigungen der Signalqualität, wie Intensitätsgradienten, „Doughnut“-Artefakte etc. verantwortlich.

Totvolumina-freie Nanopumpen ohne bewegliche Teile Die Advalytix AG hat jetzt Nanopumpen entwickelt, die eine effektive Agitation kleinster Probenmengen ohne zusätzliche Totvolumina ermöglicht. Die Pumpen sind auf der Oberfläche von Chips integriert, die anstelle eines Deckglases in der üblichen Inkubationsgeometrie angewendet werden können. Die Pumpen enthalten keinerlei mechanisch bewegliche Teile, zur Agitation der Flüssigkeit dienen sogenannte akustische Oberflächenwellen (Surface Acoustic Wave – SAW). Die SAW-Technik wird seit langem in der Elektronik eingesetzt, so finden sich zum Beispiel in Mobiltelefonen gleich mehrere Oberflächenwellenfilter. Zur Anregung der Wellen dienen dabei metallische Elektroden auf dem piezoelektrischen Chip. Diese sogenannten Transducer wandeln ein hochfrequentes elektrisches Signal in eine mechanische Vibration um. Mit einer Amplitude im Nanometerbereich und Wellenlängen von einigen Mikrometern breiten sich die Wellen wie Erdbeben im Nanoformat über den Chip aus 1. Dabei übertragen sie einen Teil ihrer Energie auf die Flüssigkeit an der Chipoberfläche. Abbildung 1 zeigt das Funktionsprinzip eines solchen Mischer-Chips und die AdvacardTM – eine Kunststoffkarte mit drei |transkript LABORWELT

B

L

Mischer-Chips – die in der Lage ist, den Reaktionsraum über einem Objektträger zu durchmischen. Die SAW-induzierte Strömung innerhalb eines geschlossenen Volumens führt zu einer effizienten Durchmischung der Flüssigkeit – insbesondere dann, wenn die Frequenz oder die Amplitude der SAW im Lauf des Experiments geändert wird. Die programmierbare Variation der Mischparameter verändert die Geometrie der Strömungsmuster im Kapillarspalt, so daß durch die Überlagerung verschiedener laminarer Strömungen im Lauf der Zeit eine großflächige quasi-chaotische Durchmischung erreicht wird. Abbildung 2 illustriert die Wirkung der Nanopumpen am Beispiel der Verteilung eines Farbstoffes: Die Bildreihe zeigt einen Blick auf eine Inkubationskammer, in der eine Advacard auf einen Objektträger gedrückt wird. Durch vier zusätzliche, für diesen Zweck angebrachte Öffnungen wurde Farbstoff in den Kapillarspalt zwischen Advacard und Slide pipettiert. Die untere Bildreihe zeigt die Verteilung des Farbstoffes innerhalb von 15 Minuten durch Diffusion: Die durch das Zugeben des Farbstoffs erzeugten, annähernd runden Bereiche von ca. 5 mm Durchmesser verändern sich im Beobachtungszeitraum nur wenig. Die obere Bildreihe zeigt das Experiment mit SAW-

I

T

Z

L

I

C

H

T

Nanopumpen. Hier wird der Farbstoff nach kurzer Zeit über den gesamten Reaktionsraum verteilt und die Probenlösung vollständig homogenisiert.

Applikationen Der positive Effekt der Durchmischung während der Inkubation läßt sich insbesondere bei in-situ-Messungen gut demonstrieren. Abbildung 3 zeigt die zeitliche Veränderung des Fluoreszenzsignals eines DNA-Hybridisierungsereignisses. Die Messung erfolgte in Echtzeit während der Inkubation mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops. Ohne Durchmischung (Datenreihe „signal no mix“) steigt die Signalintensität annähernd linear. Anzeichen für eine Sättigung der Reaktionskinetik sind im Beobachtungszeitraum nicht zu erkennen. Offenbar ist die Probenlösung oberhalb des Spots nach wenigen Minuten verarmt, und neue Reaktionspartner können nur mit der Diffusionsgeschwindigkeit – und damit nur sehr langsam – nachgeliefert werden. Mit Nanopumpen-Durchmischung (Datenreihe „signal mix“) wird nach etwa 90 Minuten die Sättigung erreicht. Auffallend ist die um den Faktor 4 höhere Endintensität. Die Mischtechnik macht so Kurzzeitexperimente möglich: Nach einem Viertel der Reak-

Abb. 3: Zeitliche Entwicklung der Fluoreszenzintensität eines Spots auf einem DNA-Microarray, mit („signal mix“) und ohne („signal no mix“) Durchmischung während der Hybridisierung

tionszeit sind bereits rund zwei Drittel der Signalstärke erreicht. Die Durchmischung der Probenlösung läßt sich somit auf zweierlei Weise zur Optimierung von Hybridisierungsexperimenten nutzen: In einem Langzeitexperiment ist das Sättigungssignal mit geringerer Probenkonzentration zu erzielen. Die Zeit bis zum Erreichen eines aussagefähigen Signals kann gegenüber dem ungemischten Fall verkürzt werden. Des weiteren läßt sich die Reaktionskinetik in-situ bestimmen. Abbildung 4 zeigt diese beiden Effekte am Beispiel eines am NMI, Reutlingen, entwickelten Protein-Sandwich-Assays. Die mit

 Info ordern?  Kennziffer 16 LW 03 oder www.biocom.de

Anzeige

|transkript LABORWELT

Nr. III/2002 | 13

B

A

B

L

Abb. 4: Fluoreszenzsignale eines HuIgGSandwich-Assays. A. 2x45 min. Inkubation ohne Durchmischung, B. 2x5 min. Inkubation mit Durchmischung, C. 2x15 min. Inkubation mit einem Viertel der Probenkonzentration

C

dem Pfeil markierte Spotreihe enthält AntiHuIgG-Replikas. In Bild A wurde die zweistufige Inkubation ohne Durchmischung in zweimal 45 Minuten durchgeführt. Die beiden Bilder B und C wurden nach einer Inkubation mit Durchmischung aufgenommen. Sie zeigen in der Falschfarbendarstellung annähernd dieselbe Intensität und Signalqualität, obwohl im Fall B die Inkubationszeit auf zweimal 5 Minuten verkürzt wurde. Für C wurde zweimal 15 Minuten inkubiert, jedoch die Konzentration um Faktor 4 verringert. Die positiven Effekte der Durchmischung sind für DNA-Microarrays ähnlich. Hier hängt erwartungsgemäß der Einfluß der Agitation auf die Reaktionskinetik von der Länge der verwendeten Sequenzen ab. Abbildung 5 zeigt die Auswertung eines E. coli-Arrays, dessen einstündige Inkubation mit und ohne Mischen unter ansonsten identischen Reaktionsbedingungen durchgeführt wurde. Die blauen Balken zeigen die Signale ohne Durchmischung. Für das Experiment, das durch die roten Balken dargestellt wird, wurden die Nanopumpen ohne Variation der Mischparameter betrieben, der Kapillarspalt wurde also im wesentlichen laminar durchströmt. Die Signalintensität steigt an. Eine weitere Optimierung der Reaktionskinetik wird je-

I

T

Z

L

I

C

doch im dritten Experiment erreicht, das durch Variation der Betriebsparameter der SAW-Pumpen eine quasi-chaotische Durchmischung erzielt (grüne Balken). Die Durchmischung verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis um den Faktor 4, die Spot-Homogenität erhöht sich um den Faktor 5.

Array Booster In Zusammenarbeit mit der Firma Grohmann Biotech Automation hat Advalytix ein Inkubationsgerät für Microarrays im StandardSlideformat entwickelt und unlängst vorgestellt. Der ArrayBoosterTM verfügt über vier unabhängig zu programmierende Reaktionskammern (s. Abb. 5). Die Kammern können auf übliche Inkubationstemperaturen zwischen 30 und 70 Grad Celsius temperiert werden. Der Slide wird in die Kammer eingelegt und mit einer AdvacardTM abgedeckt, wobei Spacer an den Rändern der Karte für einen Kapillarspalt einer definierten Dicke von 100 Mikrometer sorgen. Für unterschiedlich große Spotfelder stehen drei AdvacardTypen unterschiedlicher Breite mit ein, zwei oder drei Nanopumpen-Chips zur Verfügung. Die so gebildeten Kapillaren nehmen zwischen 20 und 150µl Probenflüssigkeit auf. Durch die Anfertigung applikationsspezifischer Mischerkarten kann die Menge der Probenflüssigkeit noch weiter reduziert werden. Während der Inkubation steuert ein Mikroprozessor die Nanopumpen. Durch Variation von Größen wie Amplitude und Frequenz der angelegten Wechselspannung wird eine Mischsequenz durchgeführt, die sich auf die jeweilige Reaktionskinetik und physikalische Randbedingungen, wie zum Beispiel die Viskosität des verwendeten Puffers abstimmen läßt. Abbildung 6 zeigt das Gerät mit geöffneten Kammern. Mit Hilfe der Nanopumpen-Mischtechnik läßt sich das Problem verfälschter Kinetiken in vielen kapillar dimensionierten Reaktionsräumen lösen. Neben der diskutierten Anwendung zur Inkubation von Microarrays ist auch ihr Einsatz in der Färbung oder in-situHybridisierung von Gewebeschnitten in der Erprobung. Da die Oberfläche der Mischer-

H

T

Chips mit einem weiten Spektrum von passivierten oder reaktiven Schichten belegt werden kann, ist ihr Einsatz in allen biochemisch relevanten Reaktionsmilieus möglich. Die Pumpen sind frei von beweglichen Teilen und Totvolumina, die Gefahr von Kontaminationen wird so minimiert. Das Chipmaterial ist transparent, in hoher optischer Qualität verfügbar und zeigt keine Eigenfluoreszenz, so daß sich Nanopumpen auch problemlos in optische Echtzeit-Analysegeräte integrieren lassen, etwa in einer Küvetten-Geometrie. Denkbar ist auch die Integration in Mikround Nanotiterplatten. Die Nanopumpen sind in der Lage, nicht nur Flüssigkeiten, sondern auch in Flüssigkeit suspendiertes Material gezielt zu bewegen. Erste Tests zeigen gute Ergebnisse bei der Agitation von suspendierten Zellen. Die erzeugten Strömungen rei-

Abb. 6: ArrayBoosterTM-Inkubationsstation für Standard-Microarrays mit vier Kammern. In einer Sandwich-Geometrie von Advacard und Slide wird die Probenflüssigkeit mit Hilfe von SAW-Nanopumpen durchmischt.

chen aus, um selbst adhärierte Zellen von der Oberfläche zu lösen, ohne ihre Vitalität negativ zu beeinflussen. In diesem Zusammenhang verspricht das Konzept des „intelligenten Slides“ mit integrierten Pumpen interessante neue Anwendungen.

Literatur [1] „Nano-Beben auf dem Chip“, Achim Wixforth, Physikalische Blätter 54, 649 (1998)

Korrespondenzadresse

Abb. 5: E. coli-Array nach einer Stunde Inkubation; blau: ohne Durchmischung, rot: mit laminarer Durchströmung des Kapillarspalts, grün: mit quasi-chaotischer Durchmischung 14 | Nr. III/2002

Dr. Jürgen Scriba Advalytix AG Eugen-Sänger-Str. 53.0 D-85649 Brunnthal Tel.: 089-607-45831, Fax: 089-607-45810 eMail: [email protected], www.advalytix.de

Kennziffer 17 LW 03
Info ordern?
|transkript LABORWELT

B

L

I

T

Z

L

I

C


Drug Discovery

Biochip für die Analyse zellulärer Ionenkanäle Niels Fertig1, Michèle Klau2, Michael George1, Robert Blick2, Jan C. Behrends2 Nanion Technologies GmbH, München, 2Center for NanoScience (CeNS) der LMU, München

1

Die Elektrophysiologie (Patch-clamp) ist der Standard für die pharmakologische Validierung potentieller Medikamente, die auf Ionenkanäle wirken. Das klassische Patch-clamp-Verfahren ist aber nicht hochdurchsatzfähig, was eine Voraussetzung für einen Einsatz bei der Wirkstoffsuche ist. Wir stellen hier eine neue chipbasierte Patch-clamp-Methode vor, die mit Hilfe mikrostrukturierter Glas-Chips elektrophysiologische Messungen an Zellen ermöglicht. Die Technologie ist automatisiert und parallelisierbar und eignet sich damit für den Hochdurchsatz. Eine der wichtigsten Eigenschaften von Zellen ist ihre Erregbarkeit. Durch physikalische oder chemische Reize werden in der Zellmembran Ionenkanäle geöffnet oder geschlossen. Ionenkanäle sind Proteine, die in ihrem Inneren eine für Ionen durchlässige Pore bilden können. Sie sind für den Grundlagenforscher interessant als elementare erregbare Strukturen in der Biologie und für den Arzt oder Pharmakologen als Angriffspunkt einer großen Zahl wichtiger Medikamente, beispielsweise gegen epileptische Anfälle, Herzrhythmusstörungen, Bluthochdruck und Diabetes. Um die Ionenkanalfunktion direkt analysieren zu können, ist es notwendig, eine elektrisch leitfähige Verbindung zum Zellinneren zu schaffen. Der Grundstein dazu wurde vor mehr als 50 Jahren mit der Entwicklung von Ultramikroelektroden gelegt (Ling & Gerard 1949). Bringt man ein dünnes Glasröhrchen in der Mitte zum Schmelzen und zieht dann rasch an beiden Enden, bis die beiden Hälften getrennt sind, so entstehen zwei Glaspipetten mit Spitzendurchmessern

A

von wenigen Mikrometern oder weit darunter. Diese Mikropipetten können mit einer elektrisch leitenden Salzlösung gefüllt und durch die Membran in die Zelle eingestochen werden, um Spannung und Strom über die Zellmembran zu messen (intrazelluläre Ableitung). Ihren Höhepunkt erreichte die Mikropipettentechnologie jedoch mit der Patch-clampTechnik (Hamill et al. 1981, Neher & Sakmann 1995). Sie wurde von Erwin Neher und Bert Sakmann (Nobelpreis für Medizin oder Physiologie 1991) entwickelt und erlaubte erstmals Messungen von Strömen durch einzelne Ionenkanäle und damit den eigentlichen Beweis für deren Existenz. Die Idee war, einen nur wenige Mikrometer großen Fleck (patch) der Zellmembran mit Hilfe eines elektronischen Rückkopplungs-Schaltkreises bei einer definierten elektrischen Spannung zu halten (oder zu ‚klemmen‘: clamp), um dann anhand des Rückkopplungs-Signals den Ionenstrom durch dieses Areal zu beobachten. Dazu wurde die Mikropipette nur aufgesetzt, statt sie durch die

B

Abb. 1: Die durch „klassische Mikrostrukturierung“ hergestellte Glas-Mikropipette und die subzellulären Dimensionen aktueller Festkörperstrukturen A: Der Prozeß des lokalen Erhitzens und Auseinanderziehens eines Glasröhrchens (Schema oben rechts) resultiert in Aperturen mit µm-Öffnungen, die hier in sukzessive stärker vergrößerten Aufnahmen im Rasterelektronenmikroskop (REM) gezeigt sind (im Uhrzeigersinn von links oben). B: Gegenüberstellung von zwei REM-Aufnahmen einer kultivierten Nervenzelle (großes Bild) und eines Nano-Resonators aus der Arbeitsgruppe Blick am Lehrstuhl für Halbleiterphysik (Prof. Dr. Kotthaus) bei gleicher Vergrößerung. Man beachte, daß die Dimensionen der kleinsten Bestandteile der künstlich hergestellten Struktur in der gleichen Größenordnung liegen, wie die der kleinsten subzellulären Fortsätze des Neurons. 16 | Nr. III/2002

H

T

Membran in die Zelle zu stechen. Es stellte sich heraus, daß sich insbesondere durch leichtes Einsaugen des unter der Pipettenöffnung befindlichen Membran’flecks’ ein sehr enger Kontakt zwischen Glas und Zellmembran und damit gegenüber dem außerhalb von Zelle und Pipette befindlichen Medium eine sehr gute Abdichtung erreichen läßt. Ein hoher elektrischer Widerstand dieser Kontaktzone, der üblicherweise deutlich über einer Milliarde Ohm (1 GOhm) liegt, verringert zufällige Störsignale soweit, daß es möglich ist, die winzigen Ströme (einige Billionstel Ampère) zu messen, die durch einzelne Proteinkanäle fließen. Eine weitere wichtige Entdeckung war, daß man durch weiteres, stärkeres Ansaugen des Membranflecks diesen im Inneren der Pipette zerreißen kann, ohne deswegen die gute Abdichtung nach außen zu verlieren. Dadurch wurde ähnlich wie bei der intrazellulären Ableitung ein elektrischer Zugang zum Inneren der Zelle gebildet. In dieser Konfiguration wird also die gesamte restliche Zellmembran auf einem kontrollierten Potential festgehalten (Whole-cell-Patchclamp, Ganzzell-Ableitung). Diese Weiterentwicklung ermöglichte es nicht nur, Ionenströme mit nie dagewesener Auflösung aufzuzeichnen, sondern auch, von Zellen, ihren Fortsätzen oder gar von Organellen abzuleiten, die zu klein sind, um den Einstich einer intrazellulären Glasmikroelektrode zu ‚überleben‘. Heute ist „Patch-clamping“ die am häufigsten verwendete Ableittechnik in der zellulären Elektrophysiologie.

Von der Pipette zum Chip Obgleich sich die Anwendungsmöglichkeiten der durch Schmelzen und Ausziehen entstehenden, mikroskopisch feinen Hohlnadeln beträchtlich erweitert haben, ist die zur Herstellung der Mikropipetten verwendete Technik noch immer dieselbe. Tatsächlich ist kaum ein eleganteres Verfahren als diese „klassische Mikrostrukturierung“ denkbar, um ein Werkzeug von subzellulären Dimensionen mit einem etwa streichholzdicken und damit handhabbaren Griff herzustellen (Abb. 1A). Dennoch wird seit einigen Jahren in verschiedenen Arbeitsgruppen der Versuch unternommen, statt der Hohlnadelspitze eine mikrometergroße Öffnung (Apertur) in einem Chip-ähnlichen, planaren Träger für das „Patch-clamping“ zu verwenden (Schmidt et al. 2000, Fertig et al. 2000, Fertig et al. 2001, Klemic et al. 2002, Fertig et al. 2002). Da Festkörperstrukturen mit Hilfe von modernen Mikro- und Nanostrukturierungstechniken leicht auf subzelluläre Dimensionen gebracht werden können (Abb. 1B), ist die Nutzbarmachung für biologische Fragestellungen naheliegend. Um das Patch-clampVerfahren mit einem mikrostrukturierten Chip durchzuführen, ist es zweckmäßig, die |transkript LABORWELT

B

L

I

T

Z

L

I

C

H

T

Abb. 2: Prinzip des klassischen Patch-clamping mit der Mikropipette (A) und des Patch-clamping mit Hilfe einer Apertur in einem planaren Substrat-Chip (B). Im klassischen Verfahren wird die Öffnung der Pipette unter Sicht mit Hilfe eines x-y-z-Manipulators auf die Zelle plaziert. Im Gegensatz wird beim „Patch-clamp-on a-chip“ die Zelle durch Unterdruck auf der Apertur positioniert. Manipulator und Mikroskop entfallen. In C ist die Strukturierung schematisch dargestellt und REM-Aufnahmen einer durch Ionenspurätzen erzeugten Apertur abgebildet. Das obere Bild zeigt den Eingang des Konus, das untere den Ausgang der Apertur, die perfekt rund und glatt ist, wodurch die Bildung eines hohen Abdichtwiderstandes ermöglicht wird.

räumliche Beziehung von Zelle und Ableitöffnung umzukehren: anstatt eine Hohlnadel an die Zelle heranzubewegen, sollte die Zelle auf einer Öffnung in einem planaren Substrat in Position gebracht werden (Patch-clamp-on-a-chip, Abb. 2). Eine solche Anordnung bietet verschiedene Vorteile: 1. Geringeres Meßrauschen: Während der Abschlußwiderstand zwischen Zellmembran und Glas für hochauflösende Messungen möglichst hoch sein sollte, gilt für den Innenwiderstand der Mikroelektrode sowie für ihre elektrische Kapazität das Gegenteil. Je niedriger Innenwiderstand und Kapazität, desto geringer sind störende zufällige Signalfluktuationen (Rauschen). Bei der Pipette bildet sich die mikrometerfeine Spitze erst am Ende eines einige Millimeter langen, dünnen Schaftes. Dies bedeutet erstens, daß der Strom durch die Pipette über eine Endstrecke von mehreren 100 µm einen relativ großen Widerstand überwinden muß, und daß zweitens die Wand der Pipette in diesem Bereich sehr dünn ist, was eine hohe Kapazität bedingt. Bei der mikrostrukturierten Apertur in einem z.B. nur 200 µm dicken Substrat kann nun diese entscheidende Endstrecke auf einige wenige Mikrometer verkürzt werden, da die mikroskopische Öffnung nicht durch Ausziehen sondern beispielsweise durch Ätzverfahren gebildet wird. Bei diesen reicht eine viel kürzere Strecke aus, um auf sub-µm-Dimensionen zu kommen. Außerdem ist in einer planaren Anordnung die Apertur überall von einer sehr dicken Wand umgeben, so daß die Kapazität ebenfalls verringert wird. Beides zusammen bewirkt eine verbesserte Meßauflösung. 2. Die planare Geometrie ermöglicht einen einfachen Zugang für gleichzeitige optische Messungen – besonders für solche, die Objektive mit großer numerischer Apertur und mit geringem Arbeitsabstand erfordern oder die durch Lichtstreuung an der Pipette gestört würden. Zudem ermöglicht es der flache Aufbau, elektrische Ableitungen an Zellen oder Membranflecken mit dem lokalen Einsatz von Rastersondenverfahren zu kombinieren, wie etwa der Rasterkraftmikroskopie oder der optischen Nahfeldmikroskopie. 3. Parallelisierung: Flache Chips können im Gegensatz zu Mikropipetten mit hochgradig parallelen Verfahren hergestellt werden, wie sie aus der Halbleitertechnologie bekannt sind. Zudem können mehrere Aperturen in einen Chip eingebracht werden, so daß viele Messungen gleichzeitig durchgeführt werden können.

Anzeige

Kennziffer 18 LW 03 oder www.biocom.de
Info ordern?
|transkript LABORWELT

Nr. III/2002 | 17

B

L

4. Automatisierung: Der flache Aufbau des Chips und die Tatsache, daß die Zelle und nicht die Apertur bewegt werden muß, vereinfachen das Prozedere erheblich: Die einzige bewegliche Komponente ist die Zelle – daher kommt ein solches Verfahren ohne Manipulatoren oder optische Kontrollinstrumente aus. Darüber hinaus sind relative Bewegungen von Apertur und Zelle ausgeschlossen, so daß keine Vibrationsdämpfung mehr erforderlich ist. Der gesamte Prozeß eignet sich unter diesen Bedingungen viel eher zur Automatisierung als das klassische Patch-clamp-Verfahren.

Mikrostrukturierung Bei ersten Versuchen wurden Substrate auf der Basis von Silizium verwendet, weil für die Strukturierung dieses Materials seit langem Standardmethoden etabliert sind. Das Silizium wurde mit Siliziumnitrid beschichtet und daraufhin „unterätzt“, so daß sich freitragende Siliziumnitridschichten ausbilden lassen. In diese Isolatormembran lassen sich feine Öffnungen einbringen, um so die Geometrie der Pipettenspitze nachzubilden. Es ist zudem möglich, Zellmembranen stabil in der Apertur zu plazieren (Fertig et al. 1999). Im Verlauf der Versuche traten jedoch einige gravierende Nachteile dieses Materials zutage, die allesamt mit den Halbleitereigenschaften des Siliziums zu tun haben (schlechte elektrische Isolation, Photoeffekt, Autofluoreszenz). Aufgrund der zu geringen Kontaktfläche mit der nur wenige 100 Nanometer dicken Siliziumnitridschicht ist die Geome-

Abb. 3: Ableitungen von Zellen mit Hilfe des Patch-clamp-Chips. A: Schema der Zellpositionierung aus der Suspension durch Unterdruck. B: Lichtmikroskopisches Bild einer auf der Apertur positionierten CHO-Zelle. C: Ganzzell-Ableitung (s. Einleitung) von einer CHO-Zelle. Es wurde eine Serie rechteckförmiger Spannungsbefehle steigender Amplitude angelegt (obere Spuren), wodurch die von dieser Zelle exprimierten Kaliumkanäle geöffnet werden (Kontrolle: mittlere Spuren). Nach Zugabe des Skorpiontoxins Charybdotoxin (ChTX, untere Spuren) ist dieser Strom erwartungsgemäß blockiert. D: Messung von Einzelkanalströmen mit dem Chip. In dem untersuchten Membranfleck befinden sich mehrere Kanäle. Die durchgezogenen Linien zeigen die Stromstufen an, zwischen denen das Signal durch das statistische Öffnen und Schließen einzelner Kanäle fluktuiert. 18 | Nr. III/2002

I

T

Z

L

I

C

H

T

trie der Siliziumproben für die Ausbildung eines elektrisch dichten Abschlusses zwischen Membran und Chip zudem ungeeignet. Aufgrund dieser Schwierigkeiten kehrten wir zum klassischen und für Patch-Clamp Pipetten bewährten Material zurück – dem Glas –, das all diese Nachteile nicht aufweist. Zwar existieren keine Standard-Techniken, mit denen sich Aperturen im µm- bis sub-µmMaßstab in Glas herstellen lassen, jedoch verfügt die Gesellschaft für Schwerionenforschung in Darmstadt über eine geeignete Methode. Beim Einzelionenspur-Ätzen (Single-Ion-Track-Etching, (SITE), Spohr 1990), wird ein einzelnes hochenergetisches, vielfach geladenes, schweres Ion (z.B Au+18) durch eine dünne Glasmembran geschickt und hinterläßt eine Störung der Struktur im Substrat (die so genannte Ionenspur, Abb. 2C). Diese Spur wird naßchemisch deutlich schneller geätzt als das intakte Grundmaterial. Durch einseitiges Ätzen können kegelförmige Poren mit einem Enddurchmesser von mehreren µm bis unter 1 µm (Abb. 2C) hergestellt werden. Die so produzierten Aperturen sind vollständig rund und glatt und eignen sich daher gut für die Ausbildung eines elektrisch dichten Kontakts mit den Zellen. Die Möglichkeit, die Geometrie der Pore durch die Wahl des Substrats zu verändern, macht das Verfahren zusätzlich attraktiv.

Elektrophysiologische Experimente mit planaren Mikrostrukturen aus Glas Für die Anwendung im Drug Screening ist das Ziel, mit der planaren Glas-Apertur die Aktivität von Ionenkanälen in Zellen zu detektieren. Weiterhin sollen zu testende Substanzen an den Zellen appliziert werden, um deren pharmakologische Wirkung auf die Ionenkanäle zu bestimmen. Der Kontakt mit dem Zellinneren wird im wesentlichen genau so hergestellt, wie es bei der konventionellen Ganzzell-Ableitung geschieht (s.o), nur daß die Zellen in Suspension aufgebracht und dann durch Ansaugen auf die Apertur positioniert werden (Abb. 3A, B). Die ersten Zellen, an denen wir eine erfolgreiche Ganzzell-Ableitung auf dem Glaschip durchführten, waren N1E115-Neuroblastom-Zellen. Seitdem haben wir eine Vielzahl anderer Zellinien erfolgreich verwendet, wie etwa Chinese Hamster Ovary (CHO), Human Embryonic Kidney (HEK) und NG108 Neuroblastom/Gliom-Hybridzellen. Solche Zellinien werden im Drug Screening häufig verwendet, weil sie sich nahezu unbegrenzt vermehren und gentechnisch dazu gebracht werden können, beliebige Proteine herzustellen. Als Beispiel ist die Ableitung einer genetisch veränderten CHO-Zelle gezeigt, die einen Kalium-Ionenkanal exprimiert (Abb. 3C, Fertig et al. 2002). Mit dem Patch-clamp-Chip können auch Ströme durch einzelne Kanäle gemessen werden (Abb. 3D).

Abb. 4: Parallelisierung und Automatisierung des „Patch-clamping“. A: Eine gebrauchsfertige Matrix von Aperturen in einem Glassubstrat. Diese Aufnahme im Reinraum veranschaulicht die Möglichkeit der Parallelisierung. B: Schema des in Entwicklung befindlichen Patch-ClampAutomaten. Der Prototyp wird 4x4-Matrizes verwenden. Die Applikation von Testsubstanzen erfolgt ebenfalls automatisch mit Hilfe eines Mehrkanal-Pipettierroboters.

Parallelisierung und Automatisierung Planare Aperturen eröffnen die Möglichkeit, Patch-Clamp-Messungen zu automatisieren und zu parallelisieren. Ein solches Gerät, das für das „Hochdurchsatz-Patch-clamping“ geeignet wäre, wird von der pharmazeutischen Industrie dringend erwartet, da sich mit ihm eine Vielzahl von möglicherweise auf Ionenkanäle wirkenden Substanzen in kurzer Zeit auf ihre Wirkung hin testen ließe (Xu et al. 2001; Sigworth et al. 2002). Man kann sich andererseits eine ganze Reihe äußerst interessanter Projekte der Grundlagenforschung vorstellen, die in den Bereich der „Ionenkanal-Proteomics“ oder „Channelomics“ (Jurkat-Rott et al., im Druck) fallen, und die mit der jetzigen seriellen Arbeitsweise kaum realisiert werden können. Sie könnten sich zum Beispiel mit der Frage beschäftigen, wie sich systemische Veränderungen – etwa epileptische Anfälle oder Lernvorgänge – auf die Expression und Funktion von Ionenkanälen in Gehirnzellen auswirken. Darüber hinaus wird es ein Hochdurchsatz-Gerät – wie wir es entwickeln – ermöglichen, in einem vertretbaren zeitlichen Rahmen für jede Mutante oder Variante eines Ionenkanals ein vollständiges pharmakologisches Profil zu erstellen. Solche Projekte müssen sich heute auf wesentlich weniger präzise und weniger quantitative Messungen stützen, wie etwa die Abschätzung von Änderungen des Membranpotentials mit Hilfe optischer Methoden (s. z.B. Adkins et al. 2001). Solche Experimente würden zudem von der Tatsache profitieren, daß die untersuchten Zellen durch ihre Position auf dem Chip eindeutig identifizier|transkript LABORWELT

B

L

I

T

Z

L

I

C

H

T

bar sind. So können sie wegen der guten optischen Eigenschaften des Glas-Chips parallel zur elektrophysiologischen Ableitung mit Fluoreszenztechniken untersucht werden. Die Nanion Technologies GmbH entwickelt derzeit ein zuverlässig arbeitendes Hochdurchsatz-Patch-clamp-Gerät. Der erste Prototyp des Geräts wird 16 Ableit-Positionen besitzen, von denen je vier gleichzeitig mit automatischem Lösungsaustausch und hochqualitativer elektrischer Ableitung untersucht werden können (Abb. 4). Die Erfolgsrate der für die Messung notwendigen Sealbildung liegt je nach Zelltyp etwa bei 40 bis 60%, so daß mit einem solchen Gerät acht verwertbare und stabile Ableitungen je 16fach-Chip erreicht werden können. Eine typische Messung, wie etwa die Erstellung einer Konzentrations-Wirkungs-Kurve mit 10 unterschiedlichen Konzentrationen und jeweils 8 Wiederholungen an verschiedenen Zellen, wird dann in ungefähr 30 Minuten abgeschlossen sein. Wird eine solche Messung wie heute üblich von Hand durchgeführt, benötigt man rund eine Woche. Der von Nanion entwickelte Patch-clamp-Automat vereinfacht und beschleunigt elektrophysiologische Untersuchungen von Ionenkanälen deutlich. Die Technologie findet daher ihren Einsatz im Drug Screening-Prozeß der Pharmazeutischen Industrie bei der Entwicklung von Ionenkanalmodulatoren, aber auch im Forschungslabor von Universitäten und Instituten, die auf dem Gebiet der Ionenkanäle tätig sind.

Danksagung Die Autoren danken den Professoren J.P. Kotthaus und H.E. Gaub (beide Sektion Physik und Center for NanoScience, LMU München) sowie G. ten Bruggencate (Physiologisches Institut, LMU München) für ihre stete Unterstützung und Dr. C. Trautmann (Gesellschaft für Schwerionenforschung, Darmstadt) für die Einführung in die und die Hilfe bei der Ionenspur-Strukturierung. Die CHO-zellen wurden freundlicherweise von der 4SC AG, MArtinsried, zur Verfügung gestellt.

Anzeige

Literatur Adkins CE, Pillai GV, Kerby J, Bonnert TP, Haldon C, McKernan RM, Gonzalez JE, Oades K, Whiting PJ, Simpson PB. α4β3δ GABA(A) receptors characterized by fluorescence resonance energy transfer-derived measurements of membrane potential. J. Biol. Chem., 276:38934-38939 (2001). Fertig, N., Tilke, A., Blick, R.H., Behrends J.C., ten Bruggencate, G. and Kotthaus, J.P.. Stable integration of isolated cell membrane patches in nanomachined aperture. Appl. Phys. Lett. 77:1218-1220 (2000). Fertig, N., Meyer, Ch., Blick, R.H., Trautmann, Ch. and Behrends, J.C.. Microstructured glass chip for ion channel electrophysiology. Phy. Rev. E (Rap. Com.). 64:040901 (2001). Fertig, N, Blick, RH, Behrends, JC. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys. J. 82: 3056-3062 (2002). Hamill, O.P., A. Marty, E. Neher, B. Sakmann and F.J. Sigworth, Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. 391(2):85-100 (1981). Jurkat-Rott, K., Rüdel, R., Lehmann-Horn, F.: Channelomics. In: Myology, 3rd edition (Eds. Engel, C Franzini-Armstrong). Wiley, New York, im Druck. Klemic KG, Klemic JF, Reed MA, Sigworth FJ. Micromolded PDMS planar electrode allows patch clamp electrical recordings from cells. Biosens Bioelectron. 17, 597-604 (2002). Ling, G , Gerard, RW. The normal membrane potential of frog sartorius fibres. J. Cell. Comp. Physiol. 34:383-96 (1949). Sakmann, B., and E. Neher. Single Channel Recording. Plenum Press, New York (1995). Schmidt C, Mayer M, Vogel H. A Chip-Based Biosensor for the Functional Analysis of Single Ion Channels. Angew. Chem. Int. Ed. 39, 3137-3140 (2000). Sigworth, FJ, Klemic KG. Patch clamp on a chip (New & Notable). Biophys. J. 82: 2831-832 (2002). Spohr, R. Ion tracks and microtechnology. Vieweg, Braunschweig (1990). Xu, J., Wang, X., Ensign, B., Li, M., Wu, L., Guia, A. and Xu, J. Ion-channel assay technologies: quo vadis? Drug Discovery Today 6:1278-1287 (2001).

Korrespondenzadresse Nanion Technologies GmbH Pettenkoferstraße 12, 80336 München Tel.: 089-5996 260, Fax: 089-5996 250 eMail: [email protected]

Kennziffer 19 LW 03oder www.biocom.de
Info ordern?
|transkript LABORWELT

Nr. III/2002 | 19

B

L

I

T

Z

L

I

C


Proteomics

Neue Protein-Microarrays und Zytokin-Detektions-Chips Dr. Jens Beator, Schleicher & Schuell Bioscience GmbH, Dassel

Anwendungsspektrum von Protein-Microarrays

Überlegungen zum geeigneten Substrat

Nach den DNA-Microarrays rücken ProteinMicroarrays immer stärker in den Mittelpunkt des Interesses, etwa um Proteom-Studien durchzuführen. Bereits Ende der achtziger Jahre beschrieb Ekins1, daß „MikrospotAssays“ von herausragender Nachweisempfindlichkeit sind, und ähnliche Ansätze wurden bereits für die Herstellung von Antikörper-Makroarrays beschrieben (z.B. 2). Die im Zuge der Genomforschung etablierten Geräte-Entwicklungen der letzten Jahre ermöglichten auch die Herstellung von ProteinMicroarrays („Proteinchips“) – mit vielen tausend Proben auf kleinster Fläche. In jüngster Zeit ist eine ganze Reihe neuer experimenteller Ansätze beschrieben worden, die neue Perspektiven im Rahmen der Proteom-Forschung aufzeigen. Tabelle 1 zeigt eine Auswahl vielversprechender Anwendungen und Publikationen, die das Einsatzspektrum von Protein-Microarrays eindrucksvoll belegen.

Die Anforderungen an eine ideale ProteinMicroarray-Plattform lassen sich gut definieren: kompatibel mit vorhandenen Spotting-Robotern und Auswertungssystemen, geeignet für gängige Detektionsmethoden (inklusive Fluoreszenz), hohe und gleichmäßige Bindungskapazität sowie reproduzierbare Oberflächeneigenschaften. Für Proteinnachweise hat sich seit Jahrzehnten Nitrozellulose, mit der spezifische und hochempfindliche Nachweise vom Western Blot bis hin zum immunchromatographischen Schwangerschaftstest möglich sind11, als geeignetes Substrat erwiesen. Besonders wichtig ist hier die Erfahrung, daß Antikörper und Antigene auf Nitrozellulose weit über ein Jahr hinaus ihre molekulare Erkennungsund Bindungsspezifität behalten. Ohne diese Eigenschaft wäre zum Beispiel die Vielzahl kommerziell erhältlicher Western BlotStreifen mit verschiedensten Antigenen und

Tabelle 1: Anwendungsbeispiele Protein-Microarrays Beschreibung Zellysate verschiedener Gewebe3 oder IEF-Proteinfraktionen4 wurden gespottet, Antigene mit Antikörpern und gängigen Detektionssystemen nachgewiesen Antikörper-Microarrays Antikörper wurden gespottet und inkubiert mit biotinylierten Zellysaten (kolorimetrische Detektion)5, Leukozyten (mikroskopische Auswertung)6 oder GFP/RFP (Fluoreszenz-Detektion)7 Antigen-Microarrays Bakterielle Oberflächen-Antigene wurden gespottet und spezifische IgM- oder IgG-Bindung in Human-Seren nachgewiesen (Fluoreszenz-Detektion)8 ProteindomänenFusionsproteine aus GST und verschiedenen Proteindomänen Microarrays wurden gespottet, neue Protein-Protein-Interaktionen bzw. -Bindungsprofile wurden nachgewiesen (Fluoreszenz-Detektion)9 Zytokin-Detektionschip Parallele Detektion von bis zu 16 Zytokinen in einer Probe im „Protein Microarray ELISA“ (Fluoreszenz-Detektion)10

Microarray-Western

A

B

Abb. 1: Nitrozellulosestruktur. A: Zellulose, B. nach Nitrierung; der Substitutionsgsgrad der Hydroxylgruppen beträgt 1,9 bis 2,4. 20 | Nr. III/2002

H

T

Antikörpern für die Immundiagnostik nicht denkbar. Nitrozellulose wird durch Nitrierung von Zellulose hergestellt (Abb. 1) und ist der Grundstoff für die Herstellung von Membranen in reproduzierbarer, gleichmäßiger Qualität. Der Rohstoffauswahl kommt dabei eine wesentliche Bedeutung zu. Eine Membran kann als „flacher Schwamm“ aufgefaßt werden (Abb. 2), der aufgrund seiner mikroporösen Struktur eine enorme Oberflächenvergrößerung aufweist. Daher besitzt eine Nit-

Abb. 2: Mikroporöse Nitrozellulosestruktur, FAST Slide, rasterelektronenmikroskopische Aufnahme, 30.000 fach.

rozellulosemembran eine sehr hohe Bindungskapazität bzw. sehr hohe Nachweisempfindlichkeit verglichen mit planaren Oberflächen. Aufgrund dieser Erfahrungen war es naheliegend, Objektträger (Slides) mit dreidimensionaler Nitrozellulosebeschichtung zu entwickeln (FAST™ Slides), die eine gute Gerätekompatibilität mit idealen Immobilisierungsund Nachweiseigenschaften vereinen.

Vergleich von Plattformen für Microarrays Wie sehen die Ergebnisse in der Praxis aus? Sam Hanash (Präsident der Human Proteomics Organization HUPO) hat die Eignung von Aldehyd-, Amino- und Nitrozellulosebeschichteten Objektträgern verglichen4. Im Ergebnis war die Nachweisempfindlichkeit für Antigene in verschiedenen Proteinfraktionen auf Nitrozellulose-beschichteten Slides (FAST Slides) am höchsten. Die Arbeitsgruppe um Liotta an den National Institutes of Health (NIH) in Bethesda, USA, hat in einer Methodenentwicklung die Kanzerogenese in verschiedenen Zellgruppen untersucht3. In einem Microarray-Western wurde die Nachweisempfindlichkeit auf FAST Slides am Beispiel des Markerproteins PSA (Prostata-spezifisches Antigen) näher untersucht: Die Nachweisgrenze lag im Bereich von wenigen Femtogramm, also im zeptomolaren Bereich (10–21 Mol). Die Signale waren linear und quantifizierbar in einem Bereich von 1,25 fg bis 20 fg. Eine plausible Erklärung für diese hohe Nachweisempfindlichkeit auf FAST Slides

Kennziffer 20 LW 03
Info ordern?
|transkript LABORWELT

B

L

I

T

Z

L

I

C

Tabelle 2: Nachweisplattformen im Vergleich. n.v.: Daten nicht verfügbar

FAST Slides AldehydSlides AminoSlides

NachweisMicro-Western3 empfindlichkeit4, 7 ++++ 10–21 Mol PSA fg PSA ++ n.v.

Probenverlust nach Spotting7 ≤5%

TNFα α10

IL-210

1 pg/ml

10 pg/ml

95 %

n.v.

n.v.

+

n.v.

n.v.

n.v.

n.v.

liefert die Arbeit von Wu7, in der verschiedene Slides für Studien zu Protein-ProteinWechselwirkungen untersucht wurden. Aldehyd- oder Aldehyd-ähnliche Beschichtungen zeigten nach Inkubation, Waschen und Detektion einen Verlust von 95% der ursprünglich aufgetragenen Proteinmenge, während die Nitrozellulose-Beschichtung weniger als 5% Verluste aufwies. Die dreidimensionale Schwammstruktur der FAST Slides führt zu wesentlich höherer Aufnahme- und Bindungskapazität für Proteine im Vergleich zu anderen Slides und wird als Ursache für die höhere Nachweisempfindlichkeit betrachtet. Tabelle 2 enthält eine Übersicht verschiedener Nachweisplattformen.

Reproduzierbarkeit Mit der Nitrozellulose-Dünnbeschichtung von Objektträgern ohne Klebemittel können physikalisch-chemische Inhomogenitäten von Glas und störende Einflüsse von Klebern praktisch ausgeschlossen werden. Die dreidimensionale Nitrozellulose-Beschichtung gewährleistet daher eine reproduzierbare Fertigung – für die Herstellung von Proteinchips beispielsweise zur Quantifizierung in Expressionsstudien eine wichtige Voraussetzung. Daneben wurde beobach-

tet, daß die Spot-zu-Spot-Reproduzierbarkeit auf FAST Slides deutlich gleichmäßiger ist als auf planaren Oberflächen: CV ≤ 5 % bei geeigneten Spot-Robotern(eigene Untersuchungen, 3) . Die aufgetragenen Proben werden von der mikroporösen Struktur gleichmäßig aufgenommen und immobilisiert. Ebenso gleichmäßig ist die Signalabgabe bei der anschließenden Detektion, verstärkt durch die große spezifische Oberfläche.

22 | Nr. III/2002

T

Darüber hinaus ist für die Fluoreszenzdetektion von Protein-Microarrays eine scheinbar widersprüchliche Protokollanpassung von entscheidender Bedeutung: Sowohl für die Blockierung als auch für die nachfolgenden Waschschritte sollten keine Blockierungsreagenzien auf Proteinbasis eingesetzt werden. Die „Eigenfluoreszenz“ auf FAST Slides wird vernachlässigbar, wenn ohne BSA, Kasein oder Milchpulver nur mit z. B. TBS-Tween 20 (Tris Buffered Saline, TWEEN 0,1%, bis zu 2%) blockiert und gewaschen wird.

Neue Horizonte: Human-Zytokin-Detektionschip In einer neuen Methodenentwicklung wurde ein ELISA für 16 verschiedene Human-Zytokine im Microarrayformat entwickelt10. In A

Fluoreszenzdetektion Die Fluoreszenzmarkierung ermöglicht hochempfindlichen Nachweis, Quantifizierung und Mehrfachmarkierung (siehe auch LABORWELT I/2002; II/2002, S. 6). Daher wurde schon früh versucht, Fluoreszenzdetektion auf Membranen vor allem für den DNA/RNA-Nachweis zu etablieren. In vielen Fällen wurde dabei eine nicht akzeptable Hintergrundfluoreszenz auf den Membranen beobachtet. Bei der Entwicklung der FAST Slides wurde diesem Aspekt besondere Aufmerksamkeit geschenkt. Durch Optimierung der Rezeptur und Herstellungstechnologie ohne Kleber und Stützgewebe für eine sehr dünne Beschichtung von nur 15µm (im Vergleich zu 100 bis 120µm bei Membranen) konnte die „Eigenfluoreszenz“ drastisch gesenkt werden.

Tabelle 3: ELISA und Protein-Microarray-ELISA für die Human-Zytokin-Detektion10. fett: bessere Nachweisgrenze bzw. Linearität

Human-Zytokin Angiogenin ICAM-1 IFN-γγ β IL-1β IL-2 IL-4 IL-6 IL-8 IL-10 IL-12p40 IL-12p70 IL-13 IP-10 TGF-1 α TNF-α TNF RII VEGF

H

Nachweisgrenze [pg/ml] Microarray ELISA 1 3,2 100 80 100 10 1 10 10 400 100 16 10 10 1 16 100 80 1 80 10 16 100 80 10 100 32 80 1 10 10 80 1 16

linearer Bereich [log-Einheiten] Microarray ELISA 3 3 2 2 2 3 3 1 3 1,5 2 1 3 1,5 2 2 2 2 3 1 2 1 2 2 3 1,5 3 2 2 1,5 3 2 3 1

B

Abb. 3 A: Zytokin-Mengen in Zellkultur nach Lipopolysaccharid-Behandlung (LPS). Links: –LPS, rechts +LPS. Nach LPS-Behandlung (5 µg/ml, 6 h) wurden Lysate von THP1-Lymphozyten 1:4 mit Medium verdünnt und mit dem ProVision™ HCA-Human-Zytokin-Array inkubiert. Gebundene Zytokine wurden nachgewiesen mit biotinyliertem Antikörper-Cocktail und Streptavidin-Cy5. Links: –LPS, Kontrolle, endogene Zytokin-Expression, rechts: +LPS, erhöhte Zytokin-Expression. Chip-Belegung: siehe 3B, oberste und unterste Reihe sind Detektionskontrollen („landing lights“) 3B: Chip-Belegung des Human-Zytokin-Detektionschips mit monoklonalen Antikörpern

Abbildung 3 ist als Anwendungsbeispiel die Änderung des Zytokin-Expressionsmusters in einer Zellkultur nach Lipopolysaccharid-Behandlung (LPS) dargestellt. Um die Leistungsfähigkeit des Protein-Microarray-ELISA näher zu charakterisieren, wurden separat für jedes Zytokin die Nachweisgrenze und der lineare Meßbereich mit einem kommerziell erhältlichen ELISA-System verglichen. Für die meisten Zytokine war die Nachweisempfindlichkeit im Protein-Microarray deutlich besser als in der Mikrotiterplatte, und auch der linea|transkript LABORWELT

B

L

I

T

Z

L

I

C

H

T

re Meßbereich war für fast alle Zytokine größer (Tab. 3). Darüber hinaus lassen sich im Protein-Microarray mehrere Zytokine parallel in derselben Probe quantifizieren. Die Verwendung eines speziell entwickelten Array-Puffers führte dabei zu einer konstant hohen Signalverstärkung verglichen mit anderen üblichen Auftragspuffern über einen Zeitraum von vielen Monaten. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen haben zur Entwicklung eines kommerziell erhältlichen Human-Zytokin-Detektionschips geführt (ProVision™ HCA).

Ausblick Die Publikationen in Tabelle 1 zeigen das enorme Anwendungspotential von Protein-Microarrays. In den USA werden derzeit Großforschungsprogramme zur Proteom-Forschung auf Basis von Protein-Microarrays auf FAST Slides geplant (z. B. vom NHLBI, National Heart, Lung, and Blood Institute, Proteomics Initiative). Weitere Anwendungsgebiete sind denkbar – etwa zur Identifizierung neuer Protein-Protein-Wechselwirkungen für die pharmazeutische Wirkstoffsuche oder die Entwicklung von Proteinchips für diagnostische Anwendungen. Die hohe Nachweisempfindlichkeit, reproduzierbare Fertigung und Langzeitstabilität von Protein-Microarrays auf FAST Slides sprechen dafür, daß diese Plattform zum weltweiten Standard wird. Zur Erhöhung des Probendurchsatzes werden multiple Arrays auf einem Slide (wie z. B. im HumanZytokin-Detektionschip, s.o.) voraussichtlich eine große Rolle spielen.

Literatur [1] Multi-analyte immunoassay. R.P. Ekins, (1989) J. Pharm. Biomed. Anal. 7, 155– 168 [2] Antibody arrays for high-throughput screening of antibody-antigen interactions. R.M. de Wildt, I.M. Tomlinson (2000), Nature Biotechnology 18, 989-994 [3] Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front. C.P. Paweletz, L.A. Liotta (2001); Oncogene 20, 1981-1989 [4] Protein based microarrays: A tool for probing the proteome of cancer cells and tissues. (2001) Madoz-Gurpide, S.M. Hanash; Proteomics 1, 1279-1287 [5] Proteomic profiling of the cancer microenvironment by antibody arrays. (2002) V. Knezevic, D.B. Krizman, Proteomics 1:1271-1278 [6] Immunphenotyping of leukemias using a cluster of differentiation antibody microarray. (2001) L. Belov, R.I. Christopherson; Cancer Research 61, 4483 – 4489 [7] Protein microarrays to detect protein-protein interactions using red and green fluorescent proteins. T. Kukar, D. Wu; (2002) Analytical Biochemistry 306, 50 – 54 [8] Carbohydrate microarrays for the recognition of cross-reactive molecular markers of microbes and host cells, D. Wang, A. Wang; Nature Biotechnology 20, 275– 281, 2002 [9] A protein-domain microarray identifies novel protein-protein interactions. (2002) A. Espejo, M.T. Bedford; Biochemical Journal, immediate e-publication, doi:10.1042 BJ20020860 [10] Development of a multi-cytokine assay panel in a protein microarray format on a nitrocellulose surface - comparison to traditional ELISA assays. Tonkinson, J.L., Osborn, D.S. and Stillman, B.A. Oak Ridge Conference (2002) [11] Nitrocellulose: A tried and true polymer finds utility as a post-genomic substrate. J.L. Tonkinson and B.A. Stillman (2002), Frontiers in Bioscience 7, 1-12

Anzeige

Korrespondenzadresse Dr. Jens Beator Marketing Manager Life Science Schleicher & Schuell BioScience GmbH Postfach 1160, 37582 Dassel Tel.: 05561-791 415, Fax: 05561-791 583 eMail: [email protected]

Kennziffer 21 LW 03 oder www.biocom.de
Info ordern?
|transkript LABORWELT

Nr. III/2002 | 23

R

E

P

O

R


Protein-Arrays

Proteinchips – neue Werkzeuge für Diagnostik und Proteomics Christian F. Vöhringer, Dieter Stoll, Markus F. Templin, Thomas O. Joos NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut an der Universität Tübingen Durch die Verfügbarkeit von Protein-Microarrays verändern miniaturisierte Assaysysteme auch die Proteinforschung. Für die Herstellung und Auswertung der Proteinmicroarrays kann die aus der DNAArray-Technologie bereits bekannte, kommerziell erhältliche Technik eingesetzt werden. Fängermoleküle werden in Reihen und Spalten auf Trägermaterialien immobilisiert. Zur Detektion und Quantifizierung der Zielmoleküle werden Ligandenbindungstests durchgeführt, deren Auswertung heute überwiegend auf fluoreszenzbasierten Methoden beruht. Die Protein-Microarray-Technologie ermöglicht eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Analyse vieler Parameter bei geringstem Material- und Probenverbrauch – Eigenschaften, die vor dem Hintergrund individualisierter Therapiestrategien besondere Bedeutung erlangen. Auch für die Proteomforschung, die in der „post genomic era“ im Zentrum des Interesses steht, weist die Protein-Microarray-Technologie wegen ihrer HochdurchsatzTauglichkeit enormes Potential auf. Key Words: Protein-Microarray-Technologie, Ambient Analyte Assay, Immunoassay, Ligandenbindungstest

Mit dem Abschluß verschiedener GenomSequenzierungsprojekte begann die sogenannte „post genomic era“. Der Wissenschaft stehen jetzt Informationen über die strukturelle Organisation der Genome zahlreicher Organismen zur Verfügung, über die Anzahl der darin vorhandenen Gene und deren potentielle Genprodukte. Das nächste Ziel ist jetzt die Identifizierung definierter Produkte eines bestimmten Gens und die Zuordnung einer Funktion für dieses Genprodukt.

Das Proteom als Korrelat des physiologischen Zustands Der funktionelle Status einer Zelle, eines Organs oder Organismus korreliert mit der Zusammensetzung der aktuell vorhandenen Gesamtheit aller Proteine einer Zelle – ihrem

Proteom. Das Proteom unterliegt ständigen Veränderungen, das heißt, das Genom einer Zelle codiert viele Proteome. Das Erfassen der dynamischen Veränderungen, der eine Zelle auf der Proteinebene unterliegt, ist möglicherweise ein Weg zum Verständnis der molekularen Wechselwirkungen, auf der die zelluläre Regulation beruht. Ziel der Proteomforschung ist es darum, das Vorkommen, die Menge und die posttranslationalen Modifikationen aller Proteine einer Zelle oder eines Gewebes zu definierten Zeitpunkten zu erfassen1. Für das Verständnis von physiologischen oder pathophysiologischen Prozessen in Zellen und Geweben ist die Aufklärung der beteiligten Proteine der erste wichtige Schritt. Etablierte DNA-Chip-Technologien erlauben die Analyse von Expressionsmustern einer Zel-

T le. Die Analyse tausender mRNA-Populationen auf einem einzigen DNA-Chip2 liefert Information über die Transkription bestimmter Gene. Die vorhandene mRNA-Menge korreliert aber nicht notwendigerweise mit der Menge der tatsächlich synthetisierten Proteine und liefert deshalb nur Hinweise auf die Expression der betreffenden Proteine. Das Erstellen von Expressionsmustern auf Proteinebene erfolgt zumeist als vergleichende oder substraktive Analyse. Hierbei werden „behandelte“ und native Zellen verglichen, um Veränderungen im Expressionsniveau bestimmter Proteine zu verfolgen. Klassischerweise werden Proteinfraktionen beider Zellpopulationen parallel mittels 2D-Gelelektrophorese untersucht. Mehrere tausend Proteine können dabei in einem Einzelexperiment aufgetrennt und anschließend mittels massenspekroskopischer Analytik (Peptid mapping) identifiziert werden. Die Effizienz dieser Methodik erlaubt es allerdings nicht, alle Proteine einer Zelle in einem Einzelexperiment zu erfassen. Auch lassen sich diese Techniken nur schwierig in automatisierte Prozesse einbinden. Im Zuge der Anstrengungen, geeignete Alternativen zu entwickeln, wurde deshalb versucht, die bereits etablierten Methoden der DNA-Chip-Technologie für Proteine nutzbar zu machen. Am Beispiel des Gene Expression Profiling zeigen sich die Vorteile von parallelisierten Microspot-Arrays gegenüber konventionellen Methoden besonders deutlich. Proteinoder mRNA-Proben, die aus den zu vergleichenden Zellpopulationen stammen, werden mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert – damit ist die Herkunft jeder Probe anhand ihrer Fluoreszenzfarbe zu ermitteln. Für die eigentliche Analyse werden gleiche Mengen beider markierter Proben gemischt und auf einem Microarray mit Spots von spezifischen Antikörpern hybridisiert. Das Verhältnis der Intensität der beiden Fluoreszenzfarbstoffe zueinander gibt Auskunft über

Abb. 1: Miniaturisierte Assaysysteme – Signaldichte und Gesamtsignal im Microspot. Der Verlauf von Signaldichte (Signalintensität/Fläche) und Gesamtsignalhöhe (Signalintensität) wurde für ansteigende Fängermolekülmengen im Microspot ermittelt. Da die Belegungsdichte der Fängermoleküle für alle Microspots identisch bleibt, repräsentieren größere Microspots steigende Mengen an Fängermolekül. Das Gesamtsignal (Gesamtsignal-Intensität) wächst ebenfalls mit steigender Fängermolekülmenge an und erreicht ein Maximum, wenn praktisch alle in der Probe verfügbaren Fängermoleküle im Microspot gebunden sind. Für Microspots mit kleiner werdender Fläche, in denen weniger Fängermoleküle immobilisiert sind, wächst dagegen der Wert für die Signaldichte (Signalintensität /Fläche) an und erreicht einen nahezu konstanten Wert wenn die Fängermolekül-Konzentration den Wert 0,1/ K unterschreitet (K für Assoziationskonstante). Diese Bedingungen entsprechen den Voraussetzungen für den Ambient Analyte Assay: die Konzentration der freien Zielmoleküle in der Probe wird durch die Komplexbildung mit den im Microspot immobilisierten Fängermolekülen praktisch nicht verändert. Die Abbildung wurde aus [4] modifiziert, die Signalintensität bzw. der abgeleitete Flächenquotient (Signaldichte) sind in der Abbildung logarithmisch skaliert. 24 | Nr. III/2002

|transkript LABORWELT

R

E

P

Abb. 2: Vergleichende Proteomanalyse. Die erfolgreichsten Strategien um bestimmte Genaktivitätsmuster physiologischen oder pathologischen Zuständen zuordnen zu können (Genom- und Proteomanalyse) verfolgen substraktive oder vergleichende (komparative) Ansätze. Biomoleküle, die das Proteom einer Zelle oder eines Gewebes repräsentieren (Proteine, DNA oder mRNA) werden aus zwei phänotypisch unterschiedlichen Quellen isoliert und einer kompetitiven Analyse unterzogen. Im allgemeinen werden dazu die Proteomkorrelate aus den beiden Vergleichsproben mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert – in der Abbildung rot (behandelte Probe) und grün (native Kontrolle) dargestellt. Auf diese Weise lassen sich die Proteine aufgrund ihrer Fluoreszenzfarbe einem der beiden Phänotypen zuordnen. Unterschiede im Expressionsmuster die charakteristisch für einen Phänotyp sind, lassen sich mit diesen Vergleichsproben relativ einfach ermitteln. Die markierten Proteome beider Phänotypen werden zu gleichen Anteilen gemischt und auf einem Microarray analysiert. Im Test konkurrieren identische Zielproteine aus jeder Probe um die spezifischen Fängermoleküle im Microspot. Werden die Fluoreszenzbilder für beide Fuoreszenzfarbstoffe passend übereinander gelegt, lassen sie sich auf die resultierende Farbe hin auswerten. Aus der resultierenden Farbe eines Spots lassen sich Rückschlüsse auf die Menge des jeweiligen Proteins in den Proben der zwei Phänotypen ziehen. Wird ein Protein in der Testsituation gegenüber der Kontrollsituation hochreguliert, ist zu erwarten, daß die resultierende Fluoreszenzfarbe des entsprechenden Microspots der behandelten Probe entspricht (in der Abbildung rot). Wird die Expression eines Proteins in der Testsituation gegenüber der Kontrollsituation unterdrückt, ist die Fluoreszenzfarbe der Kontrolle (in der Abbildung grün) zu erwarten. Für unveränderte Expressionsverhältnisse ist entsprechend die resultierende Mischfarbe zu erwarten (in der Abbildung gelb).

O

R

T

Anzeige

das Expressionsniveau eines bestimmten Proteins in der behandelten Probe gegenüber der unbehandelten Kontrolle (Abb. 2).

Erhöhte Sensitivität durch Miniaturisierung – Ambient Analyte Assay Protein-Microarray-Experimente wurden von Roger Ekins und Mitarbeitern bereits in den achtziger Jahren beschrieben3. Sie entwickel-

Kennziffer 22 LW 03 oder www.biocom.de
Info ordern?
|transkript LABORWELT

Nr. III/2002 | 25

R A

B

ten ein Microspot-Assay-System für den immunologischen Nachweis von TSH (thyroid stimulating hormone) und HbsAg (Hepatitis B-Oberflächenantigen). Mit diesem Immunoassay konnten beide Analyten noch in femtomolaren Konzentrationen (106 Moleküle pro ml) quantifiziert werden. Die von Ekins formulierte „Ambient Analyte Assay“-Theorie beschreibt, aus welchem Grund miniaturisierte LigandenbindungsAssays eine signifikant höhere Sensitivität besitzen können als Immunoassay-Systeme im herkömmlichen Maßstab. Von entscheidender Bedeutung für das Funktionsprinzip dieser Ligandenbindungs-Assays ist die Miniaturisierung des Systems. Die Fängermoleküle werden auf einer extrem kleinen Fläche – dem Microspot – an eine feste Phase gekoppelt. Obwohl die Gesamtmenge der Fängermoleküle sehr klein ist, sind diese im Microspot in einer sehr hohen Dichte angeordnet. Die im Microspot immobilisierten Fängermoleküle bilden mit ihren Zielmolekülen Komplexe aus, deren Anzahl durch die Menge der Fängermoleküle limitiert – also gering – ist. Aus diesem Grund bleibt die Konzentration der freien Zielmoleküle in der Probe praktisch unverändert. Dies gilt selbst für Komplexe mit sehr hohen Affinitätskonstanten oder bei niedriger Konzentrationen der Zielproteine in der Probe. Unter Bedingungen, bei denen im Microspot nicht mehr als 0,1/ K Fängermoleküle immobilisiert sind, wobei K die Affinitätskonstante des Komplexbildungsprozesses sein soll, spricht man vom „Ambient Analyte Assay“. Hier korrelieren die Meßwerte für den Anteil des im Komplex gebundenen Zielproteins direkt mit der Gesamtkonzentration des Zielproteins in der Probe. Messungen unter solchen Bedingungen sind darüber hinaus unabhängig vom eingesetzten Probenvolumen, was hochsensitive Assays bei minimalem Materialverbrauch ermöglicht. Es gibt zwei Tatsachen, die die erhöhte Sensitivität des Ambient Analyte Assays erklären: 26 | Nr. III/2002

E

P

O

R

T

Abb. 3: Quantitative Proteomanalyse. In Abbildung A ist die Quantifizierung diverser Proteine einer Probe dargestellt. Die verschiedenen Proteine wurden mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und können parallel in einem Microarray-Experiment detektiert werden. Dazu werden die entsprechenden Proteine der Probe über Fängerantikörper spezifisch gebunden, die in den Microspots immobilisiert sind. Die Intensität des Signals korreliert mit der Menge des gefangenen Proteins. Geeignete Kontrollspots, wie Positiv- und Negativproben sowie interne Standards, die zur Kalibrierung mitgeführt werden, erlauben eine sehr verläßliche Quantifizierung der Proteine mittels Microarrays. B. Im Reverse Phase Assay repräsentiert jeder Microspot das Proteom einer Zelle oder eines Gewebes (Abb. B) – oder Teile davon. Diese Palette unterschiedlicher Proteine wird anschließend in multiplexen Assays analysiert, wobei unterschiedlich markierte, spezifische Antikörper parallel eingesetzt werden können. Auf diese Weise lassen sich theoretisch mit N Antikörpern (markiert mit N unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen) N unterschiedliche Proteine in einem einzigen Spot analysieren. Limitierend sind neben der begrenzten Anzahl geeigneter Fluoreszenzfarbstoffe, die Anzahl der Anregungswellenlängen in den Arrayscannern und die Kompatibilität der entsprechenden Antikörper untereinander.

 die Komplexbildungsreaktion findet bei maximaler Konzentration des Zielmoleküls statt,  die Fänger-Zielmolekülkomplexe bilden sich auf einer extrem kleinen Fläche – dem Microspot –, was zu einer hohen lokalen Signalintensität führt (Abb. 1). Folgende Überlegung verdeutlicht diesen Zusammenhang: Auf einer Oberfläche werden Microspots zunehmender Fläche aus einer Fängermoleküllösung konstanter Konzentration erzeugt. Mit zunehmender Spotfläche nimmt also die Gesamtmenge an immobilisierten Fängermolekülen zu, was zu einem ansteigenden Gesamtsignal für den jeweiligen Spot im Assay führt. Da das entsprechende Zielprotein nicht in unbegrenzter Menge in der Probe vorhanden ist, nimmt jedoch die Signaldichte mit wachsender Spotfläche ab. Die Bildung der Komplexe aus Fänger und Zielprotein führt zu einer Abnahme der Konzentration freier Zielproteine in der Probe, und gleichzeitig sind die gebildeten Komplexe auf einer größeren Fläche verteilt. Dies resultiert in einem geringeren Maximalsignal pro Fläche für einen Spot mit großer Fläche. Für kleine Spots wird zwar das Gesamtsignal kleiner, die Signaldichte aber steigt an (Abb. 1). Von einer bestimmten Spotfläche an erreicht der Wert der Signaldichte ein Optimum und wächst nicht weiter an (unter Ambient Analyte Assay-Bedingungen ist die Zielproteinmenge kein limitierender Faktor)4.

Molekulare Diagnostik und Proteomforschung Für die Herstellung planarer Protein-Microarray-Systeme werden vor allem aktivierte Glasoberflächen oder Membranmaterialien (Nitrocellulose, Polyvinyl u.a.) mit niedriger Eigenfluoreszenz eingesetzt. Für die Generierung und Auswertung der Mikrospots werden die kommerziell erhältlichen Spottingsysteme und Laserscanner verwendet, die aus der DNA-Array-Technologie bekannt sind: Nadel-basierte Kontaktdrucksysteme oder Mikrodispensiersysteme (Ink-Jet- oder

Elektrospray-Technologie; www.biochipnet. de). Mit diesen Systemen werden automatisiert Nanoliter der Fängermoleküllösungen in Reihen und Spalten auf dem Trägermaterial abgesetzt und dort fixiert. Die Detektionssysteme beruhen überwiegend auf der Messung von fluoreszenzmarkierten Molekülen (markierte Liganden oder markierte Detektionsantikörper). Alternativ kommen in den letzten Jahren verstärkt kapillare „microfluidic“ Arrays (Lab on a chip) oder „Bead“basierte Systeme zur Quantifizierung von Proteinen aus komplexen biologischen Proben zum Einsatz. Hier werden die spezifischen Fängermoleküle auf farblich kodierte Mikrosphären aus Polystyrol gebunden und über eine modifizierte FACS-Analyse (Fluorescence Activated Cell Sorting) ausgewertet5. Neben Nachweisverfahren, die eine Markierung (Fluoreszenz, Chemilumineszenz, Radioaktivität, Bioitin) der nachzuweisenden Proteine erfordern, werden auch markierungsfreie Detektionsverfahren (Surface Plasmon Resonance SPR, Massenspektroskopie u.a.) entwickelt. Basierend auf den Arbeiten von Ekins wurden im Bereich der medizinischen Diagnostik in den letzten Jahren einige Arbeiten zur qualitativen und quantitativen Analyse einer Vielzahl unterschiedlicher Proteine mit Hilfe von multiplexen Protein-Microarrays publiziert6-8. Bisher existiert allerdings noch kein Microarray-basierter Nachweis auf dem Diagnostikmarkt. Die Vorteile und die Zugänglichkeit dieser miniaturisierten Technologie für Automatisierungsprozesse machen die Protein-Microarray-Assays besonders geeignet für High Throughput-Anwendungen, wie sie beispielsweise im Wirkstoffscreening der pharmazeutischen Industrie oder für die molekulare Diagnostik9 existieren. Diskutiert wird ebenfalls, komplexe Fragestellungen in der Proteomforschung mit „array based proteomics“-Ansätzen anzugehen. Hierbei sollen tausende spezifischer Fängermoleküle auf kleinstem Raum auf Trägermaterialien immobilisiert werden, um definierte Proteine |transkript LABORWELT

R

E

P

O

R

T

(Partial-Proteom) aus dem komplexen Proteingemisch des GesamtProteoms schneller und kostengünstiger als bisher zu quantifizieren10,11. Kostengünstige, hochspezifische Fängermoleküle sind für die „array based proteomics“ unbedingte Voraussetzung und werden dazu in großer Anzahl benötigt. Sie können zum einen durch klassische Immunisierungstrategien (polyklonale und monoklonale Antikörper), zum anderen über molekularbiologische Methoden wie die Phage-Display-Technologie erhalten werden. Zu den rekombinant erzeugten Fängermolekülen zählen auch Antigen-bindende Fragmente wie Fab oder scFv. Das sind Antikörperderivate die in vitro einer Affinitätsselektion unterworfen und damit für spezifische Anforderungen optimiert werden können („in-vitro-Evolution“). Denkbar sind auch ganz andere Fängermoleküle, wie DNA- und PeptidAptamere oder Affibodies, die durch die Modifikation von Bindeproteinen bakterieller Herkunft erzeugt werden (Übersicht in [12]). An diese Fängermoleküle können etwa Proteine des Gesamt-Proteoms binden, die zuvor an geeigneten funktionellen Gruppen (Amino-, Carbonsäuregruppen, Tyrosin) spezifisch markiert wurden. Nachdem Proteine ausgewaschen wurden, die unspezifisch an die Microarray-Oberfläche adsorbiert sind, werden die spezifischen Komplexe ortsaufgelöst mit geeigneten Detektionssystemen nachgewiesen13. Im „Reverse phase protein microarray“14 werden ganze Proteinfraktionen, die aus Zell- oder Gewebemikrosektionen gewonnen werden, auf Trägermaterialien fixiert. Jeder Microspot repräsentiert hier das Proteom einer, mit einem Krankheitsverlauf korrelierbaren, histologisch veränderten Gewebeprobe oder von angrenzendem, nicht verändertem Gewebe. Diese Proteome werden auf molekulare Korrelate der vorliegenden Erkrankung untersucht, die von prognostischem Wert für eine individualisierte Therapiestrategie sein können. Prinzipiell lassen sich für Protein-Microarray-Systeme alle molekularen Wechselwirkungen einsetzen, bei denen sich zwei Partnermoleküle spezifisch erkennen. Dazu zählen neben den erwähnten Antigen/Antikörper-Reaktionen die Nukleinsäure/Protein-, Peptid/Protein-, Protein/Protein-, Rezeptor/Ligand- und Enzym/Substratmolekül-Wechselwirkung (Abb. 4, S. 29). Oligonukleotid-Arrays können bei der Charakterisierung und Identifizierung von DNA-bindenden Proteinen wie Transkriptionsfaktoren eingesetzt werden. Enzym/ Substrat-Arrays wurden bereits für die Untersuchung so unterschiedlicher Enzymklassen wie Restriktionsendonukleasen, Peroxidasen, Phosphatasen und Proteinkinasen eingesetzt. Mit rekombinant exprimierten Enzymen wurden bereits neue spezifische Substrate einzelner Kinasen identifiziert. Zur Identifikation neuartiger Liganden für Rezeptormoleküle wurden niedermolekulare organische Verbindungen mittels kombinatorischer Chemie erzeugt und ihre Affinität zu möglichen Zielproteinen ermittelt. Die Verfügbarkeit synthetischer Peptide und rekombinanter Proteine erschließt die Möglichkeit, das breite Feld der Protein/Protein-Interaktionen mittels Microarrays zu untersuchen. Die enormen Möglichkeiten, die diese Technologie für die Proteomforschung bietet, demonstriert die Arbeit von Zhu et al.15. Exemplarisch wurde dazu die Interaktion von Calmodulin mit 5.800 unterschiedlichen, rekombinant erzeugten Proteinen (ca. 90% des gesamten Hefegenoms) auf einem einzigen Chip analysiert. Neben der Bestätigung bekannter Interaktionen wurden dabei auch neuartige Bindungspartner für Calmodulin identifiziert.

Anzeige

Möglichkeiten und Grenzen der Protein-Microarray-Technologie Die Protein-Microarray-Technologie weist enormes Potential für die Immundiagnostik in der medizinischen Forschung auf. Sie kombiniert die hochparallelisierte, schnelle und kostengünstige Analyse

Kennziffer 23 LW 03 oder www.biocom.de
Info ordern?
|transkript LABORWELT

Nr. III/2002 | 27

R

E

P

O

R

T

Abb. 4: Fängermolekülklassen für den Einsatz in Protein-Microarrays. Diverse Klassen von Biomolekülen können in Microspots als Fängermoleküle immobilisiert werden. Die Interaktionen mit ihren spezifischen Bindepartnern können qualitativ und quantitativ erfaßt werden. Unter A ist eine Antigen/Antikörper-Wechselwirkung skizziert, B illustriert einen typischen Sandwich-Immuntest. In Abbildung C ist die Wechselwirkung eines Enzyms mit seinem spezifischen Substrat angedeutet. Dabei ist das Substrat (S) der Kinase im Microspot immobilisiert und wird spezifisch von der Kinase phosphoryliert (P). Die Interaktion von Bindemolekülen eines ganz anderen Typs ist unter D dargestellt. Diese synthetisch erzeugten Fängermoleküle werden Aptamere genannt und können aus Nukleotiden, Ribonukleotiden oder Aminosäureresten (Peptide) aufgebaut sein. In E ist die spezifische Interaktion zwischen Proteinen untereinander dargestellt. Abbildung F zeigt die Rezeptor/ Ligand-Wechselwirkung. Ein typisches Beispiel einer solchen Interaktion ist die Erkennung eines Rezeptormoleküls durch niedermolekulare Syntheseprodukte (kombinatorische Chemie), die als Fängermoleküle immobilisiert wurden.

aller wichtigen diagnostischen Parameter mit minimalem Material- und Probenverbrauch. Vor dem Hintergrund individualisierter Therapiestrategien und minimal-invasiver Eingriffe kommt dieser Eigenschaft besondere Bedeutung zu. Proteinmicroarrays ermöglichen eine engmaschige Kontrolle des Therapieerfolges mit minimalen Mengen an Biopsiematerial. Proteinexpressionsprofile biologischer Proben erlauben die Analyse und Identifikation neuer Markerproteine für die medizinische Diagnostik, aber auch grundlagenorientierte Erkenntnisse für die Proteomforschung. Trotz der vielversprechenden neuen Ideen und Technologien im Bereich der Proteinarray-Entwicklung und -Anwendung darf nicht übersehen werden, daß alle Protein-Chipbasierten Ansätze zur Proteom-Analyse nur eine Momentaufnahme der Proteinexpression oder Proteinmodifikationen einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus in einem definierten Funktionszustand liefern. Dynamische zelluläre Prozesse müssen daher zusätzlich über direkte „Functional Genomics“Ansätze – also in vivo-Funktionsanalysen von Genprodukten im direkten zellulären Kontext – analysiert werden. Erst die Kombination der Erkenntnisse aus der Proteom-Analyse und „Functional Genomics“ wird ein echtes Verständnis des dynamischen Verhaltens von Zellen und Organismen ermöglichen.

Literatur [1] Lopez, M.F., Electrophoresis 21 (2000), 1082-1093. [2] Debouck, C., Goodfellow, P.N., Nat Genet 21 (1999), 48ff. [3] Ekins, R.P., J Pharm Biomed Anal 7 (1989), 155-168. [4] Ekins, R., Chu, F., Ann Biol Clin (Paris) 50 (1992), 337353. [5] Goergen, B., Hartwig, K., Technologie-Trends Biochips Studie - DZ Bank (2001), 7- 65. |transkript LABORWELT

[6] Joos, T.O., Schrenk, M., Hopfl, P., Kroger, K.,Chowdhury, U., Stoll, D, Schorner, D., Durr, M., Herick, K., Rupp, S., Sohn, K., Hammerle, H., Electrophoresis 21 (2000), 2641-2650. [7] Sreekumar, A., Nyati, M. K., Varambally, S., Barrette, T. R., Ghosh, D., Lawrence, T. S., Chinnaiyan, A. M., Cancer Res 61 (2001), 7585-7593. [8] Mendoza, L.G., McQuary, P., Mongan, A., Gangadharan, R., Brignac, S., Eggers, M., Biotechniques, 27 (1999), 778788. [9] Walter, G., Bussow, K., Cahill, D., Lueking, A., Lehrach, H., Curr Opin Microbiol 3 (2000), 298-302. [10] Albala, J.S., Franke, K., McConnell, I. R., Pak, K. L., Folta, P. A., Rubinfeld, B., Davies, A. H., Lennon, G. G., Clark, R., J Cell Biochem 80 (2000) , 187-191. [11] Cahill, D.J., Proteomics: A Trends Guide (2000), 47-51. [12] Stoll, D., Templin, M. F., Schrenk, M., Traub, P. C., Vohringer, C. F., Joos, T.O., Front Biosci 7 (2002),13-32. [13] Haab, B.B., Dunham, M.J., Brown, P.O. , Genome Biol 2 (2001), res0004. [14] Paweletz, C.P., Charboneau, L., Bichsel, V. E., Simone, N. L., Chen, T., Gillespie, J. W., Emmert-Buck, M. R., Roth, M. J., Petricoin, Iii Ef Liotta, L..A., Oncogene 20 (2001), 1981-1989. [15] Zhu, H., Bilgin, M., Bangham, R., Hall, D., Casamayor, A., Bertone, P., Lan, N., Jansen, R., Bidlingmaier, S., Houfek, T., Mitchell, T., Miller, P., Dean, R. A., Gerstein, M., Snyder, M., Science 293 (2001) 2101-2105.

Anzeige

Korrespondenzadresse Dr. Thomas Joos NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut an der Universität Tübingen Markwiesenstr. 55 72770 Reutlingen Tel.: 07121-51530-844, Fax: 07121-51530-16 eMail: [email protected], www.nmi.de

Kennziffer 24 LW 03
Info ordern?
Nr. III/2002 | 29

B

L

I

T

Z

L

I

C


Proteomics

Neueste Entwicklungen des ProteinChip®-Systems PD Dr. Andreas Wiesner, Dr. Ralf Bogumil, Ciphergen Biosystems, Deutschland Das von Ciphergen Biosystems Inc. entwickelte ProteinChip®-System basiert auf der sogenannten surface enhanced laser desorption/ionization (SELDI)-Technologie1-3. Die hier erstmals verwirklichte on chipKombination von Chromatographie und Massenspektrometrie ermöglicht die direkte Analyse nahezu jeder proteinhaltigen Lösung und kommt dabei mit Probenmengen im µl-Bereich aus. Komplexe biologische Flüssigkeiten und stark mit Detergenz und Salz versetzte Präparationen können ohne Vorbehandlung untersucht werden. Die darin enthaltenen Proteine lassen sich quantifizieren. Die bisherigen Anwendungsgebiete vergleichendes Protein Profiling und Biomarker Discovery, schnelle und probensparende on chip-Entwicklung von Reinigungsprotokollen, verlustfreies Peptid-mapping zur Proteinidentifizierung, Monitoring von Kinaseaktivitäten und anderen enzymatischen Reaktionen sowie Antikörper-Antigen-Bindungsstudien und Rezeptor-Liganden-Interaktionen wurden unlängst um zwei wichtige Erweiterungen der Basisversion des ProteinChip-Systems ergänzt: die Biomarker PatternsTM Software, die die Aufklärung und Analyse komplizierter Proteinmuster zur Entwicklung von Vorhersagemodellen erlaubt, und das ProteinChip-Interface, das die Kopplung der ProteinChip-Arrays an TandemMS-Geräte ermöglicht.

Biomarker PatternsTM Software Die Basisversion des ProteinChip-Systems ermöglicht mit dem Biomarker Wizard ein schnelles Erkennen potentieller Biomarker: Die Signale gleicher Molekulargewichte werden dabei zu Clustern zusammengefaßt und die Intensitäten der korrespondierenden Cluster zwischen den Proben verglichen – signifikante Unterschiede weisen auf potentielle Markerproteine hin, die mit höheren Probenzahlen überprüft werden können. Dabei wird vor-

ausgesetzt, daß sich einzelne Marker in ihrer Gruppe immer ähnlich verhalten. Oft zeigen Proben jedoch Proteinmuster, bei denen es nicht leicht fällt, verläßliche einzelne Marker für ein bestimmtes Krankheitsbild oder einen definierten physiologischen Zustand zu finden. Hier setzt die neue Biomarker Patterns-Software ein. Mit ihr können komplizierte Verteilungen der Signalintensitäten analysiert und diese Muster dann gruppenspezifisch in Form eines Entscheidungsbaumes (de-

H

T

cision tree) zugeordnet werden4. Dieses praxisbewährte Verfahren5,6 hat sich als besonders geeignet erwiesen, um die vom ProteinChip-System generierten Daten auszuwerten7. Die vom Biomarker Wizard ermittelten Signalintensitäten aller Cluster werden dazu in das Biomarker Patterns-Programm importiert, gehen dort als Variable in die Analyse ein und werden zunächst in einer Lernphase zur Erstellung eines Baumdiagramms (tree building) eingesetzt (Abb. 1). Beginnend mit einem Basis-Knotenpunkt (root node), in dem alle Variablen enthalten sind, sucht das Programm nach einem Weg, die Aufspaltung in zwei möglichst „gruppenreine“ Tochter-Knotenpunkte (child nodes) zu erreichen. Dazu werden alle Variablen (also Signalintensitäten) auf ihre Befähigung als splitter überprüft, die am besten geeigneten ausgewählt und Regeln (=Schwellenwerte der Intensitäten) für die Aufteilung in die beiden Tochtergruppen erstellt. Der Prozeß wiederholt sich für jeden Tochter-Knotenpunkt, der damit gleichzeitig zu einem neuen Basisknotenpunkt wird. Das Ergebnis ist eine baumartige Verzweigung, die erst dann gestoppt wird, wenn nur noch eine Probe in einem Knotenpunkt enthalten ist oder keine Unterschiede mehr zwischen den Proben eines Knotens ermittelt werden. Die Anzahl der Tochterknoten wird dann schrittweise durch eine interne Überprüfung des Modells mit „reservierten“ Variablen (cross validation) wieder reduziert, so daß letztendlich ein praxistaugliches Baumdiagramm (optimal tree) entsteht. Es liefert Informationen über die Wichtigkeit der einzelnen Marker und gibt Auskunft über den zu erwartenden Vorhersagewert (prediction success). Dieses Modell kann dann zur Klassifizierung unbekannter Proben, also für prognostische und diagnostische Zwecke, eingesetzt werden.

ProteinChip®-Interface Das Interface kombiniert Ciphergens SELDIbasierte ProteinChip-Technologie mit den erweiterten Möglichkeiten der QqTOF TandemMassenspektrometrie, also der Peptidsequenzierung und hochgenauen Massenanalyse. Die ProteinChip-Arrays werden über eine austauschbare UV-Laserdesorptions-Ionenquelle – das Interface PCI 1000 – direkt mit Tandem-Massenspektrometern von Applied Biosystems (Sciex-Serie) oder Micromass verbunden. Anschließend können die auf den ProteinChip-Arrays befindlichen Peptide ohne Wechsel der experimentellen Plattform näher untersucht werden.

Abb. 1: Ergebnis einer Biomarker PatternsTM – Analyse (vereinfachtes Schema). Das Programm errechnet, welche Signale und Intensitäten die sauberste Gruppenaufteilung ermöglichen und nimmt danach die Zuordnug vor. Der prediction success ist der entscheidende Wert für die Praxistauglichkeit des Modells, das anschließend mit unabhängigen Datensätzen auf seine Vorhersagekraft getestet wird. 30 | Nr. III/2002

Neben der Sequenzierung der auf den chromatographischen Arrays gebundenen Proteine können zum Beispiel auch auf voraktivierten ProteinChip-Arrays Antikörper oder Rezeptoren kovalent gebunden werden und die entsprechenden Bindungspartner aus komplexen biologischen Proben spezifisch angereichert werden. Durch partielle on-chip-Pro|transkript LABORWELT

B

L

teolyse gekoppelt mit MS/MS-Analysen, ist eine Identifizierung dieser Protein-Wechselwirkungspartner oder auch ein Epitop-Mapping möglich. Auf diese Weise wurden kürzlich Rezeptor-Erkennungssegmente8 und Collagen-Bindungsproteine9 identifiziert. Der Einsatz der biologisch modifizierten Oberflächen in Kombination mit Qq-TOF-MS wird in Zukunft eine schnelle Analyse und Identifizierung von physiologisch wichtigen ProteinWechselwirkungspartnern ermöglichen. Eine weitere Anwendung ist die Anreicherung phosphorylierter Peptide durch IMAC-Gallium-Arrays, wobei mittels des Interfaces eine Sequenzierung und damit eine Bestimmung der Phosphorylierungsstelle möglich ist. Zusätzlich zu diesen speziellen Anwendungen kann das Interface auch für StandardMALDI-Anwendungen eingesetzt werden. Das PCI 1000 Interface erlaubt ein sehr schnelles Einbringen der Probe, Justierungen der Arrayposition sind nicht erforderlich. Eine besondere Eigenschaft des SELDI-Interface ist sein effizientes Ion-cooling-Design. Dies ermöglicht alle gängigen UV-MALDI Matrices, einschließlich α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (CHCA), optimal zu nutzen. Die Sensitivität liegt bei Peptiden im unteren Femtomol-Bereich sowohl im MS- als auch im MS-MS Mode.

I

T

Z

L

I

C

H

T

Abb. 2: Das ProteinChip®-Interface PCI-1000. Das Interface-Paket besteht aus dem SELDI-Interface, einem elektronischen Controller, einem leistungsstarken, hochfrequenten Stickstoff-Laser, einer fortschrittlichen Fiberoptik-Technik und einer einfach zu bedienenden Software.

Literatur [1] Weinberger, S.R, Dalmasso, E.A., Fung, E.T., Curr. Opin. Chem. Biol. 6 (2001), 86-91. [2] Wiesner, A., BioTechnologie |transkript III (2001), 47-49. [3] Wiesner, A., Bogumil, R., |transkript Laborwelt, Analytica (2002), 10-17. [4] Breiman, L., Friedman, J.H., Olshen, R.A., Stone, C.J. (1984) Classification and Regression Trees. Chapman & Hall (Wadsworth, Inc.): New York. [5] Hess, K.R., Abbruzzese, M.C., Lenzi, R., Raber, M.N., Abbruzzese, J.L. (1999) Clinical Cancer Research 5, 3403-3410. [6] Mair, J., Smidt, J., Lechleitner, P., Dienstl, F., Puschendorf, B. (1995) Chest 108, 1502-1509. [7] Adam, B., Qu, Y., Davis, J.W., Ward, M.D., Clements, M.A., Cazares, L.H., Semmens, O.J., Schell-

hammer, PF, Yasui, Y., Ziding, F., Wright, G. (2002) Cancer Research 62, 3609-3614. [8] Oren, D., Li, Y., Volovik, Y., Morris, T. S., Dharia, C., Das, K., Galperina, O., Gentz, R., Arnold, E., Nat. Struct. Biol., 9(4) (2002), 288-292. [9] Reid, G., Gan, B.S., She, Y.M., Ens, W., Weinberger, S., Howard, J.C., Appl. Environ. Microbiol., Feb. (2002), 68, 977-980.

Korrespondenzadresse PD Dr. Andreas Wiesner ([email protected]) Dr. Ralf Bogumil ([email protected]) Field Research Scientists Ciphergen Biosystems GmbH Hannah-Vogt-Str. 1 37085 Göttingen Tel.: 0551-30663-0 Fax: 0551-30663-20

 Info ordern?  Kennziffer 25 LW 03 oder www.biocom.de

Anzeige

|transkript LABORWELT

Nr. III/2002 | 31

32 | Nr. III/2002 Two lasers 635m and 532 nm

Die Detektion erfolgt durch eine CCD-Kamera, die die Two photomultiplier tubes, 16 bit digitization, auf der aktiven Fläche des Biochips erzeugte emission filters optimized for Cy3 and Cy5 Chemilumineszenz erfaßt 376 x 290 Pixel; 1000 dpi

175W Xenon-Lampe

Multicolor-Fluoreszenz-Imaging-System

1,3 Mio. Pixel hochauflösende CCD-Kamera

5. Anregung

6. Detektion/Kompomenten

ca. 33.000 g

13. Preis (ab...Euro) für Basisversion

on request

adjustable focus, laser power attenuation, small footprint. 3 Licenses of GenePixTM Pro Software included

on request

automatic filter wheel for additional emission filters, small footprint. 2 Licenses of GenePixTM Pro Software included.

H

Proteinchips basieren auf standardisierten Glassobjekträgern der Größe : 76 mm x 26 mm mit amino- oder epoxysilanisierten Oberflächen

C

12. Besonderheiten

I

Standard scope of delivery 4-6 weeks

S

Standard scope of delivery 4-6 weeks

R

GenoSensorSystem: 71.650 g Array 300: 2.144 g

GenoSensor-System: GenoSensor-Reader + Macintosh G4-Computer (128 MB) + hochauflösende CCD-Kamera + Array300-Chip

11. Standardlieferumfang

E

Multianalysegerät + Software; Laptop auf Anfrage

1 cm2

120µm Durchmesser pro Spot, Arraybereich ca. 40mm2

10. Scan area

4 orders of magnitude (10 000:1)

5-100 microns, user defined

B

GenePixPro Microarray Analysis Software: One-touch calibration and signal matching for all GenePix scanners, Full support for 16-bit grayscale TIFF images, Four-channel image analysis, Third-party image alignment, Automated barcode reading, Linear and area measurement tools, Automated block and feature alignment , Multiple methods of background subtraction and ratio calculation, Displays background pixels on the image, Manual and automatic feature flagging for quality control and normalization with user-defined criteria, Full integration with web-based genomics databases, Automatically generates Scatter Plot of any analysis measurements, including regression and standard deviation lines, Lab Book records all hardware and software operations, Integrated Array List Generator easily maps feature information (e.g., gene name) onto array image and into Results file, Array List (GAL) files allow user-defined columns, Scripting of all acquisition and analysis functions, Links directly to Acuity microarray informatics software Acuity Microarray Database and advanced Analysis Software: Hierarchical clustering with many different similarity metrics • Self-organizing maps (SOMs) with many different similarity metrics • Order dendrograms with SOMs • K-Means and K-Medians with many different similarity metrics • Principal components analysis; Gene Shaving; Find similar gene • Imports and displays full annotation data • Normalization wizard • Scripting engine for customizable analysis through VBScript, JavaScript or ActiveX objects • Dendrograms; 2-D• Interactive plots; Animated interactive 3-D plots; Line graphs • Scatter plots; Color tables; Export as PDF; Export as AVI • Supports Microsoft SQL Server 2000; ODBC-compliant • Full client/server model for effortless local, LAN or remote TCP/IP access, Includes Microsoft SQL Server Desktop Edition

Windows 2000-Applikation zur Automation der ELISA-Protokolle nach individuellen Vorgaben

9. Datenauswertung/Software

5-100 microns, user defined

Ü

Bei einer Meßzeit von 1 min können durch die CCD- 4 orders of magnitude (10 000:1) Kamera Leuchtdichten im Bereich von 20 fW/cm2 bis 0,2nW/cm2 erfaßt werden. Die Abb. löst dabei Strukturen auf der Probe mit einer Größe von ca. 20 µm auf.

T

8. Nachweisgrenze/Signal-noise ratio

Two lasers 635m and 532 nm

K

One photomultiplier tube, 16 bit digitization, 8 position filter wheel with emission filters optimized for Cy3 and Cy5

R

Keine Anregung erforderlich

Laserscanner for microarrays on standard microscope slides. Sequential scanning with 2 lasers. Detection by 1 photmultiplier and optimized digitization results in optimal signal to noise ratio and sensitivity: 0.1 fluor/micron2 (Cy3/Cy5). Automatic 8 position filter wheel for additional emission filters. Dynamic control and compensation of laser power ensures reproducibility and signal uniformity. Data transfer between Scanner and Computer via SCSI Interface. Sophisticated analysis software for reliable interpretation of scan data.

A

7. Pixel/Auflösung

Laserscanner for microarrays on standard microscope slides. Simultaneous scanning with 2 lasers reduces scan time and eliminates image alignment. Detection by 2 photmultipliers and optimized digitization results in optimal signal to noise ratio and sensitivity: 0.1 fluor/micron2 (Cy3/Cy5). Dynamic control and compensation of laserpower ensures reproducibility and signal uniformity. Data transfer between Scanner and Computer via SCSI Interface. Sophisticated analysis software for reliable interpretation of scan data

Array300-Chip: genomischer Microarray, basierend Sämtliche bekannten ELISA-Techniken auf der auf CGH-Technologie, 287 versch. Genloci in Triplikaten: 41 Subtelomere, Mikrodeletionsbereiche, Tumorsuppressorgen- und Onkogenbereiche

GenePixTM Personal 4100A (Axon Instruments) Laserscanner with integrated microarray analysis software

GenePixTM 4000B (Axon Instruments)

4. Arbeitsprinzip

Immun-o-mat Automatisierte Plattform zur Anwendung von Immu- Laserscanner with integrated microarray analysis noassays, das Gerät integriert sowohl die praktische software Durchführung des Assays, als auch die anschließende softwaregestütze Auswertung, der Protein-Chip kann mit max. 1600 Spots belegt werden

Genosensor

GenoSensor-System: GenoSensor-Reader + Macintosh G4-Computer (128 MB) + hochauflösende CCD-Kamera + Array300-Chip

Biozym Diagnostik GmbH Postfach D-31833 Hess. Oldendorf Tel.: 05152-9020 Fax: 05152-2070 eMail: [email protected] Gerhard Reich

Biozym Diagnostik GmbH Postfach D-31833 Hess. Oldendorf Tel.: 05152-9020 Fax: 05152-2070 eMail: [email protected] Gerhard Reich

2. Gerätebezeichnung/Serie

ATTO-TEC GmbH Schanzenweg 50 D-57076 Siegen Ansprechperson: Dr. Jörg Reichwein Tel.: +49(0) 271-740 4984 Fax : 49(0) 271-740 4983 eMail : [email protected]

Abbott GmbH & Co. KG Diagnostika Max-Planck-Ring 2 65205 Wiesbaden Ansprechpartner: Hubertus Reuter Te.: 06122-58 1741

3. Kurzbeschreibung des Produktes/Systems und seiner Komponenten

1. Firmenanschrift/Ansprechpartner

M T

|transkript LABORWELT

|transkript LABORWELT

R E A D E

13. Preis (ab...Euro) für Basisversion

-

12. Besonderheiten

Y

11. Standardlieferumfang

A

In der Standardausführung : 22 x 72 mm2. Maximal : 80 x 120 mm2 AT Reader ATR 01, PC mit integrierter Frame Grabber Scanner (Weißlichtquelle, CCD Detektor, integrierter Barcode Reader, 4 Wellenlängen simultan meßbar) • Reader mit PC und Software, 3 Fluoreszenzkanäle Karte und installierter Steuer- und Auswertesoftware Workstation mit Read-Write CDRW-Laufwerk, Netzwerkkarte, 1 GB RAM Analysesoftware • 17 Zoll (Cy3, Cy5, FITC). IconoClust-AT, ArrayTube Starterkit bestehend aus Monitor (Flachbildschirm auf Wunsch) • Ausführliche Einweisung vor Ort • 2. Einweisung  100 kundenspezifisch angefertigten ArrayTubes (Analysesoftware) kostenfrei auf Wunsch Im ArrayTube werden zum erstem Mal herkömkompatible mit dem BioRobotics Micro-Arrayer kompatible mit dem BioRobotics Micro-Arrayer Sehr kurze Meßzeiten im Bereich von Sekunden, mliche Mikroreaktionsgefäße mit DNA-Microarrays „MicroGrid“ (einfache Übergabe der Informationen „MicroGrid“ (einfache Übergabe der Informationen abhängig von der Labelintensität und dem Arraykombiniert, das Array stellt praktisch den Boden des der Spotbezeichnungen und der Position der Spots der Spotbezeichnungen und der Position der Spots Größe. Optional : dynamische Messungen (z.B. Reaktionsgefäßes dar. Dadurch ist eine einfache aus dem Print-Prozeß in die arrayWoRx aus dem Print-Prozess in die arrayWoRx Schmelzkurvenanalysen). Bar/Dotcode Reader. Handhabung des Arrays direkt im Reaktionsgefäß, Analysesoftware)• kompatible mit komplexen Data- Analysesoftware) • kompatible mit komplexen Datadem "Tube", mit gängigem Laborequipment möglich. • Mining Sofware-Paketen wie z.B. Spotfire(R) Mining Sofware-Paketen wie z.B. Spotfire(R) Für den Hybridisierungsnachweis wird ein robustes, nicht-fluoreszentes Markierungsverfahren eingesetzt, das auf einer katalytisch induzierten Silber-Präzipitation basiert. Die Detektion des Hybridisierungsmusters kann dadurch mit einfachen, extrem kostengüntigen Transmissionsmessungen erfolgen AT Reader Standard System bestehend aus Reader 93.900 g 74.900 g auf Anfrage ATR 01, PC mit installierter Frame Grabber-Karte und vorinstallierter IconoClust-AT Steuer- und Auswertesoftware: 19.900 g

R

10. Scan area

R In-house-Anwendungssoftware zur Datenaufnahme, -bearbeitung und -auswertung. Dadurch sind kundenspezifische Anpassungen und Erweiterungen jederzeit möglich. Spezielle Applikationspakete, z. B. für die Genexpressionsanalyse

A

9. Datenauswertung/Software

O

7. Pixel/Auflösung 8. Nachweisgrenze/Signal-noise ratio

R Filter-selektierte optische Weißlichtanregung Detektion der Filter-selektierten Fluoreszenzstrahlung mittels CCD-Imaging 16 µm < 1 Farbstoffmolekül/µm2, 14 Bit Dynamik

CCD-basierter Reader mit jeweils bis zu 6 frei wählbaren separaten Anregungs- und Emissionwellenlängen

Jena-Optronik GmbH Prüssingstr. 41, 07745 Jena Tel. : 03641-200-133, Fax : 03641-200-222 eMail : [email protected] www.jena-optronik.de Ansprechpartner: Dr. Werner Reiland Microarray Reader MAR - 4 Wissenschaftlicher Multiwellenlängen-MicroarrayReader als "In-line"- und "stand-alone"-Gerät für die gleichzeitige Bearbeitung von bis zu 4 StandardSlides (oder einer beliebigen anderen Substratgröße) in einem Mikrotiterplatten-kompatiblen frei zugänglichen Träger, der es ermöglicht, das Gerät vollautomatisch in einer Automatisierungslinie zu betreiben.

C

5. Anregung 6. Detektion/Kompomenten

GeneScan AG - Business Unit Science GeneScan AG - Business Unit Science Engesserstr. 4, 79108 Freiburg Engesserstr. 4, 79108 Freiburg Tel.: 0761-5038 0, Fax: 0761-5038 166 Tel.: 0761-5038 0, Fax: 0761-5038 166 www.genescan.com www.genescan.com Guido Lützenkirchen Guido Lützenkirchen eMail: [email protected] eMail: [email protected] arrayWoRx“auto“ Biochip Reader arrayWoRx“e“ Biochip Reader automatisiert, bis zu 25 Biochips werden autoAnregung durch eine Weißlichtquelle • Standardmatisch gescannt, optional mit individuellen Meß- filtersatz erlaubt Detektion von 89 marktgängigen parametern (z.B. Auflösung, Belichtungszeit etc.) • Fluorochromen • 4 Wellenlängen parallel detektierbar Anregung durch eine Weißlichtquelle • Standard- • auf Wunsch können kundenspezifische Filter filtersatz erlaubt Detektion von 89 marktgängigen eingebaut werden • Detektion durch High End CCDFluorochromen • 4 Wellenlängen parallel detektier- Kamera (gekühlt) • Detektion von Silberpräzipitaten bar • auf Wunsch können kundenspezifische Filter möglich • integrierter Barcode Reader • alle eingebaut werden • Detektion durch High Endgängigen Biochip Formate werden unterstützt CCD-Kamera (gekühlt) • Detektion von Silberpräzi- (metrische- oder amerikanische Standardslides, pitaten möglich • integrierter Barcode Reader • alle Schleicher & Schuell, Exiqon Euray etc) • unterstützt gängigen Biochip-Formate werden unterstützt alle gängigen Biochip Anwendungen wie Genexpres(metrische- oder amerikanische Standardslides, sion und Genotypisierung als auch Protein- und Schleicher & Schuell, Exiqon Euray etc) • unterGewebearrays • die Auflösung ist in einem Bereich stützt alle gängigen Biochip-Anwendungen wie von 3,25 bis 26 µm/Pixel frei wählbar • auch Genexpression und Genotypisierung sowie Protein- automatisiert verfügbar (siehe arrayWoRx“auto“) und Gewebearrays • die Auflösung ist in einem Bereich von 3,25 bis 26 µm/Pixel frei wählbar Der ATR 01 Reader mißt Hybridisierungsmuster eines Ein beliebiges Fluorchrom wird mittels spezifischen Excitationsfilter optimal angeregt. Die emittierte AT-Arrays online im Transmissions-Modus. Die hybri- Fluoreszenzenergie wird nach dem passieren eines Emissionsfilters auf eine CCD-Kamera geleitet. Im disierten Targetmoleküle werden dazu mit GoldparGegensatz zu verstärkenden Detektoren (PMT) integriert die gekühlte CCD-Kamera die Fluoreszenzsignale, tikeln markiert, die nach Zugabe einer Silber-Verstär- was zu einem sehr guten Signal-Rausch-Verhältnis führt kerlösung die Enstehung eines Silberniederschlags katalysieren. Das entstehende Silber-Präzipitat, das das spezifische Hybridisierungmuster abbildet, wird dynamisch oder in einer Endpunktmessung detektiert. keine Weißlichtquelle (Metall Halid, 250 Watt) Weißlichtquelle (Metall Halid, 250 Watt) optisch, Transmissionsmessungen (keine CCD-Kamera (gekühlt) CCD-Kamera (gekühlt) Fluoreszenz!), Lichtquelle LED, Detektor CCD-Kamera Pixelanzahl: 752 x 582 oder Pixelfly 3,25 bis 26 µm/Pixel frei wählbar 3,25 bis 26 µm/Pixel frei wählbar Detektion von DNA im pM-Bereich, dynamischer kleiner 0,1 Moleküle / µm2 kleiner 0,1 Moleküle / µm2 Bereich 1pM - 100nM (105 SNR: 774:1 SNR: 774:1 Der AT Reader ATR 01 wird zusammen mit Frame Generierung von 16 bit Tiff-Bildern, einzeln oder überlagert (z.B. Genexpression) • Spotfinding • Analyse Grabber-Karte und kompletter Steuer- und der Signalintensitäten der einzelnen Farbkanäle • Analyse der Ratios (Genexpression) mit vier Bildauswertesoftware IconoClust-AT geliefert Background-Subtraktionsmethoden • verschiedene implementierte Normalisierung-Methoden • Archivierungsmodul • Ergebnisstabellen kompatibel mit komplexen Analyse- und Clustering-Programmen wie z.B. Spotfire(R) • Unterstützung der Intranetanbindung (ftp-Server, Web-Server, Windows-FileSharing) 2,5 mm x 2.5 mm (Abbildung)

CLONDIAG chip technologies GmbH Löbstedterstr. 103-105, 07749 Jena Tel.: 03641-59 47 0, Fax: 03641-59 47 20 eMail: [email protected] www.clondiag.com Ansprechpartner: Dr. Karin Adelhelm ArrayTube Reader ATR 01 Lesegerät für ArrayTubes (ATs) von CLONDIAG, Die ATs bestehen aus einem StandardMikroreaktionsgefäßen mit integrierten 2 mm x 2 mm großen Microarray

I

4. Arbeitsprinzip

2. Gerätebezeichnung/Serie 3. Kurzbeschreibung des Produktes/Systems und seiner Komponenten

1. Firmenanschrift/Ansprechpartner

M R

Nr. III/2002 | 33

34 | Nr. III/2002

13. Preis (ab...Euro) für Basisversion

130 000.- g

Lizensiertes Produkt der Firma Affymetrix. Konfokaler Laserscanner mit kann neben Fluoreszenzfarbstoffen auch Radioisotope (3H, 33P, 32P, 35S, „Flying objective lens“-Technologie. Automatische Focus-Einstellung für 14C etc) detektieren Verwendung verschiedenen Slide-Formate. Sequentielles Scanning liefert Daten beider Kanäle ohne das Risiko eines Crosstalks zwischen den Farbstoffen.

12. Besonderheiten

127mm x 85 mm oder 5 glass slides mit je 74 x 23 mm gleichzeitig

Scan Area: 7500 µm x 2200 µm

Scan Area: bis zu Mikroplatten-Format

Preis ab 101.041,- g

Messung von 4 Objektträgern auf Adapter im Mikroplattenformat, Twister/Stackerintegration für Vollautomatisierung, Barcodereaderoption, erweiterte Analyse über Netzwerklizenz optional, für multiple Analyselizenzen, Windows 2000

Je nach Konfiguration Gerät mit 2, 3 oder 4 Lasern mit zugehörigen Fluoreszenzdetektionsfiltern, 1 oder 2 PMT's; PC: 1 GB RAM mit CD-Brenner, 19" Monitor, Windows 2000 und umfangreiches Software-Paket (inkl. Tecan LSA Analysesoftware

H

Gerät mit 2 Lasern und 3 Fluoreszenzdetektionsfiltern, Pentium-III Rechner, Easy-to-Use Software und Handbuch.

C

10. Scan area

I

11. Standardlieferumfang

Array-Auswertesofware AIDA Array Evaluation professional, optional: AIDA Automatisierte hocheffiziente Detektion von Array Clusterer, Partisan Array Lims Spots/Subgrids/Grids, vielfältige Methoden zur Hintergrundcharakterisierung und Datennormalisierung, umfangreiche Berechnungsmethoden und Statistikfunktionen, Gruppierung von Zellen/Grids/Bildern zur verbesserten Charakterisierung der Daten, dynamische Verknüpfung von Datentabellen und Grafiken (Histogramm, Scatterplot, Zellen/Spotinformation), Templates- und Makroprogrammierung

Der Scanner wird mit Pentium-III Rechner (500 MHz) und BedienungsSoftware geliefert

9. Datenauswertung/Software

Über Software einstellbare Auflösung: 4, 8, 10, 20, 40 µm

S

0,1 Fluorescein-Äquivalent / µm2 • Dynamischer Bereich: 5 Größenordnungen

5µ, 10µ 20µ oder 100µ selektierbar

R

0.1 Moleküle/µm2 Cy3 oder Cy5

E

10 µm Auflösung

1 oder 2 PMTs (für simultane parallele Detektion von 2 Wellenlängen) • Emissionsfilter: 1 oder 2 Filter-Schlitten, jeweils Platz für 4 Filter. Standardausstattung: 2 Laser System optimiert für CY5, CY3; 3 Laser-System: CY5, CY3 + 1 Standard-Filter; 4 Laser System: CY5, CY3, 2 Standard-Filter. Weitere Filter auf Anfrage erhältlich.

B

wählbar: Fluoreszenzdetektion mit konfokaler oder nichtkonfokaler Optik, Detektion von Radioisotopen mit Fuji IP-Technologie

Ü

< 1 Cy3 Molekül/µm2

3 Filter mit 551, 570 und 665 nm

6. Detektion/Kompomenten

T

Anregung über Laser: 633nm, 543nm, 594nm, 488nm

K

zwei oder drei interne Laser: blau (473nm) SHG, grün (532nm) SHG, rot (640nm)LD

Microarray-Scanner mit 2 - 4 Lasern und 1 oder 2 PMTs. 5-Achsen Autofokussystem mit großem optischem Arbeitsabstand ermöglicht außerordentliche Formatflexibilität und ist Garant für Reproduzierbarkeit und exzellente Uniformität; Flexible Konfokalität in Kombination mit Autofokus optimiert Signal/Hintergrund-Verhältnis für verschiedene Formate und Proben: MicroArrays oder andere Fluoreszenzsubstrate in typischen Objektträgern (mit oder ohne Deckglas), Gelen, Gewebeschnitten, Mikroplatten; Hochdurchsatz durch Automation: Slide-Adapter im MTP-Format und Barcodereader

R

7. Pixel/Auflösung

2 Laser mit 523 nm bzw. 635 nm. Photo multiplier tube (PMT).

5. Anregung

konfocaler/nicht-konfokaler Laser-Scanner mit PMT-Detektion

Microarray-Scanner mit dem beliebige Objektträger-Formate, beliebige Array-Formate und beliebige Fluoreszenz-Farbstoffe bearbeitet werden können und der auch noch in Automationslösungen integriert werden kann. Ermöglicht konfokales und nicht-konfokales Array-Scannen. Die Scanner sind in verschiedenen Laser-Konfigurationen erhältlich und bieten die Flexibilität auch dicke Substrate, Flüssigkeiten, Gele und eingekapselte Chip-Array-Formate genauso problemlos zu analysieren wie verschiedene Glas-Objektträger bis hin zum Mikroplatten-Format. Hohe Scangeschwindigkeit: 3,5 Minuten für 1 Objektträger (2 Farben parallel).

LS Series Laser Scanner

Tecan Deutschland GmbH, Theodor-Storm-Str. 17 74564 Crailsheim Dr. Jürgen Fetzer Tel. +49 7951 9417-18 Fax -42, [email protected] www.tecan.com

A

8. Nachweisgrenze/Signal-noise ratio

Konfokales Laserscanning-Gerät mit 2 Lasern und 3 Filtern. Einbau zusätzlicher Filter bzw. Laser möglich für hohe Flexibilität bei der Auswahl der Fluoreszenzfarbstoffe. Patentierte Flying Objective Lens Technologie

4. Arbeitsprinzip

Laser Scanner

FLA 8000

Affymetrix 428TM Array Scanner

Microarray Reader (Laser-System)

2. Gerätebezeichnung/Serie

Fujifilm Tokyo/ raytest Benzstraße 4 75334 Straubenhardt Dr. Michael Liebler eMail: [email protected]

MWG Biotech AG Anzinger Strasse 7a D-85560 Ebersberg eMail: [email protected] www.mwg-biotech.com Dr. Sabine Ott Tel.: 08092-8289-905

3. Kurzbeschreibung des Produktes/Systems und seiner Komponenten

1. Firmenanschrift/Ansprechpartner

M T

|transkript LABORWELT

B

L

I

T

Z

L

I

C


DNA-Microarrays

Fluoreszenzchip für die Standardisierung von Microarray-Experimenten Karin Adelhelm, Thomas Kaiser, Jens Tuchscherer, Eugen Ermantraut CLONDIAG® chip technologies GmbH, Jena Die DNA-Array-Technologie hat sich im Bereich der funktionellen Genomanalyse weltweit etabliert. Der Einsatz von DNA-Arrays ermöglicht die schnelle und hochparallele Durchführung von Genexpressions-Studien sowie von Genotypisierungs- und Mutationsanalysen. In kurzer Zeit fallen dabei eine Vielzahl von Daten an, die je nach Labor mit unterschiedlichen Arraybild-Auslesegeräten und dazugehörigen Bildauswerteprogrammen generiert wurden. Um diese Daten miteinander vergleichen zu können, ist es zwingend erforderlich, über geeignete Standardisierungs- und Normalisierungswerkzeuge zu verfügen. Hier stellen wir einen neuartigen Fluoreszenzchip vor, der den Vergleich der verschiedenen fluoreszenzbasierten Verfahren zur Bilderzeugung und Bildauswertung ermöglicht. Key Words: Fluoreszenzstandard, Microarrays, Reader-Kalibrierung, Normalisierung Der Vergleich von Daten, die im Rahmen von DNA-Microarray-Experimenten generiert wurden, ist (heute) nicht ohne weiteres möglich, selbst wenn die Daten im gleichen Labor entstanden sind. Das liegt zum einen an der großen Vielfalt der unterschiedlichen DNA-Array-Formate, die eingesetzt werden. Zum anderen hängen die Testergebnisse stark vom jeweils verfügbaren Arraybild-Auslesegerät (Array-Scanner, CCD-Mikroskope usw.) und dessen Meßparametern sowie vom jeweiligen Bildauswerteprozeß ab – im folgenden zusammen-

gefaßt als „Imaging-Parameter“1,2. Mit dem hier präsentierten Chip steht erstmals ein Werkzeug zur Verfügung, das den Vergleich und die Standardisierung von Array-Bildern erlaubt, die mit verschiedenen Imaging-Parametern erzeugt wurden.

Aufbau des Fluoreszenzchips Der Fluoreszenzstandard FluorIS (Fluoreszenz-Intensitäts-Standard) besteht aus einem Chip der Fläche 10 mm x 10 mm, der mit fluoreszierenden Strukturen verschie-

H

T

dener, genau definierter Größen und Intensitäten versehen ist. Integriert in einen herkömmlichen Objektträger-großen Halter, läßt sich FluorIS einfach in Standard-Auslesegeräten wie Microarray-Scannern einsetzen und auslesen (Abb. 1a, S. 36). Die fluoreszierenden Bereiche des Chips bestehen aus einem Polymer, das über den gesamten optisch sichtbaren Spektralbereich stabile Fluoreszenz-Eigenschaften besitzt. Die einzelnen Array-Strukturen unterschiedlicher Größe und Intensität werden mittels Mikrostrukturierungs-Techniken auf Borofloat-Glas hergestellt. Bildet man den FluorIS-Chip mit einem MicroarrayAuslesegerät wie einem Fluoreszenzscanner oder -Mikroskop ab, so lassen sich Aussagen über Auflösung und Empfindlichkeit des jeweiligen Systems erstellen. Ein typisches Fluoreszenzbild von FluorIS ist in Abbildung 1b dargestellt. Hier wurde ein FluorIS-Chips mit Array-Strukturen der Größen 4 µm x 4 µm, 8 µm x 8 µm und 32 µm x 32 µm eingesetzt. Die einzelnen Bereiche mit Strukturen gleicher Größe weisen drei genau definierte, abgestufte Intensitäten auf, mit deren Hilfe Sensitivitätsaussagen zum jeweiligen System gemacht werden können. Die Strukturen der Größe 4 µm sind nicht genau differenzierbar, da der eingesetzte Scanner – wie die meisten Array-Auslesegeräte – eine Auflösungsgrenze von 5 µm hat. Generell kann FluorIS mit beliebigen fluoreszenten Strukturen der Größen 4 µm bis 200 µm und mit variablen Intensitäts-Abstufungen gefertigt werden. Daneben ist die Herstellung von Chips mit Millimeter-großen, homogenen Polymerflächen möglich, deren Einsatz die Kontrolle der homogenen Ausleuchtung von CCD-

 Info ordern?  Kennziffer 26 LW 03 oder www.biocom.de

Anzeige

|transkript LABORWELT

Nr. III/2002 | 35

B

L

I

T

Z

L

I

C

Abb. 1: Der Fluoreszenzchip ist in einen transparenten Träger integriert, der Größe und Form eines Objektträgers aufweist (1a). Ein typisches Fluoreszenzbild von FluorIS, das mit einem konventionellen MicroarrayScanner erhalten wurde, ist in Abb. 1b zu sehen. Im vorliegenden Beispiel wurde ein Chip mit Strukturen der Größen 4 µm x 4 µm, 8 µm x 8 µm und 32 µm x 32 µm gescannt. Die einzelnen FluorIS-Felder variieren dabei in drei definierten Intensitätsabstufungen, die für die oberste Reihe in einer 3D-Falschfarben-Darstellung verdeutlicht wurden.

A

B

basierten Mikroskopen erlaubt. Die genaue Struktur kann somit an individuelle Experiment- und Gerätebedingungen angepaßt werden.

Optische Eigenschaften Eine wichtige Voraussetzung für den Einsatz von FluorIS als Werkzeug zum Vergleich verschiedener Imaging-Parameter

sind die besonderen optischen Eigenschaften des fluoreszierenden Polymers, das zur Chip-Herstellung eingesetzt wird. Die FluorIS-Strukturen weisen auch bei wiederholtem Einsatz in Lesegeräten wie Scannern über einen längeren Zeitraum stabile Fluoreszenzintensitäten auf, die nach einer Konditionierungsphase von etwa 10 Messungen erreicht werden (Abb. 2). Die Verhältnisse der einzelnen Intensitätsstufen I3/I1 und I2/I1 bleiben konstant. Damit läßt sich der Fluoreszenz-Standard optimal als Kalibrierwerkzeug zur Leistungskontrolle des eingesetzten Readers oder zum Vergleich von Bildern einsetzen, die mit verschiedenen Systemen erhalten wurden. Daneben kann der Standard bei nahezu beliebigen Anregungswellenlängen eingesetzt werden, da die Strukturen stabile Fluoreszenzeigenschaften innerhalb des sichtbaren Spektralbereichs besitzen. In Abbildung 3 sind die FluorISIntensitäten für fünf verschiedene Anregungswellenlängen dargestellt, die typischerweise verwendet werden. Für jede Anregungswellenlänge wird dabei ein eigenes „Intensitätsprofil“ erhalten, das charakteristisch für das jeweils eingesetzte Auslesegerät ist.

H

T

eingesetzten Auslesegeräte jedoch Schwankungen auf; so sind zum Beispiel Leistungsfluktuationen von Scanner-Anregungsquellen von bis zu 20 % innerhalb eines Meßtages möglich. Die Intensitätswerte der mit dem Gerät gemessenen Fluoreszenzbilder ist direkt proportional zur Energie des Anregungslichtes; die zu verschiedenen Zeitpunkten gemessenen Bilder lassen sich nicht mehr direkt miteinander vergleichen. Hier kann der Fluoreszenzstandard als Instrument zur Kontrolle und Kalibrierung der physikalischen Meßparameter eingesetzt werden. Da er stabil fluoreszierende Bereiche enthält, lassen sich nach wiederholter Detektion von FluorIS in einem Auslesegerät, z.B. vor jeder Messung eines Hybridisierungsbildes, direkt Aussagen über vorhandene Energieschwankungen machen. Mit Hilfe der Auswertung der drei Intensitätsstufen von FluorIS können die erhaltenen Resultate gegebenenfalls korrigiert werden (Abb. 4). Neben dem Einsatz von FluorIS zur Kontrolle der Meßparameter eines Reader-Systems kann er auch zum direkten Vergleich der Leistungsparameter verschiedener Auslesegeräte herangezogen werden. Auf diese Weise können auch Fluoreszenzbilder miteinander verglichen werden, die z.B. in zwei verschiedenen Laboratorien mit unterschiedlichen Scannern detektiert wurden. In Abbildung 5 sind die Werte der drei FluorISIntensitätsstufen für zwei verschiedene Array-Scanner aufgetragen. Für beide Systeme wurde ein unterschiedliches Intensitätsmuster für die drei FluorIS-Intensitätsstufen I1, I2 und I3 erhalten, das direkt die unterschiedlichen Meßparameter wie Anregungsenergie oder Detektorleistung des jeweiligen Systems widerspiegelt. Die Anwendung von FluorIS als physikalischem Standard eröffnet die Möglichkeit, Microarray-Daten, die zu verschiedenen Zeiten, mit verschiedenen Experimenten oder in verschiedenen Laboratorien generiert wurden, zu vergleichen und zu normalisieren. Damit ist ein wichtiger Schritt in Richtung vergleichbare und standardisierbare Array-Experimente unternommen. In einem

Anwendungsmöglichkeiten von FluorIS

Abb. 2: Charakteristisches Fluoreszenzverhaltens der FluorIS-Strukturen im Verlauf von 100 Einzelmessungen: Intensität der drei einzelnen Intensitätsstufen I1 (+), I2 (*) und I3 (x) von FluorIS (oberer Teil der Abbildung) und Auswertung der Intensitätsverhältnisse I3/I1 und I2/I1. 36 | Nr. III/2002

Um Resultate aus Microarray-Experimenten vergleichen zu können, die innerhalb eines Experimentes oder verschiedener Versuchsreihen gesammelt wurden, sind neben der kontrolliert reproduzierbaren ExperimentDurchführung konstante Bedingungen bei der Detektion der fluoreszenten Hybridisierungsbilder erforderlich. In vielen Fällen weisen die physikalischen Meßparameter der

Abb. 3: Mittelwerte der drei FluorIS-Intensitätsstufen, gemessen bei den Anregungswellenlängen für fünf unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe. |transkript LABORWELT

B

L

I

T

Z

L

I

C

H

T

Abb. 5: Charakteristisches Intensitätsmuster nach der Detektion von FluorIS mit zwei verschiedenen Microarray-Scannern. Die Aufnahmen wurden bei den Anregungswellenlängen für die Fluoreszenz-Farbstoffe Cy5™ und Cy3™ vorgenommen, die bei den meisten Auslesegeräten standardmäßig einstellbar sind.

Abb. 4: Verhalten der Fluoreszenzintensitäts-Stufen des Standards in Abhängigkeit von der Laser-Anregungsenergie des eingesetzten Detektionsgerätes.

zweiten Schritt wird für künftige Anwendungen ein modifizierter FluorIS-Standard verfügbar sein, der direkt im Experiment-Array, beispielsweise dem Microarray-Slide, integriert ist und damit einen noch direkteren und besseren Vergleich der Arraydaten ermöglicht.

Literatur [1] Diehl , F., Grahlmann, S., Beier, M., Hoheisel, J.D. 2001. Manufacturing DNA microarrays of high spot homogeneity and reduced background signal. Nucleic Acids Research 29 (7): e38

[2] Schuchhardt, J., Beule, D., Malik, A., Wolski, E., Eickhoff, H., Lehrach, H., Herzel, H. 2000. Normalization strategies for cDNA microarrays. Nucleic Acids Research 28 (10): e47

Korrespondenzadresse CLONDIAG® chip technologies GmbH Dr. Karin Adelhelm Löbstedter Straße 103-105 07749 Jena Tel.: 03641-59 47 0 Fax: 03641-59 47 20 eMail: [email protected] www.clondiag.com

Kennziffer 27 LW 03 oder www.biocom.de  Info ordern? 

Anzeige

|transkript LABORWELT

Nr. III/2002 | 37

B

L

I

T

Z

L

I

C

H

T


Service

Custom Chips und Custom Service für die Genexpressionsanalytik auf Microarrays Michael Gismann, BioChip Technologies GmbH, ein Unternehmen der GeneScan Gruppe, Freiburg Microarrays (Biochips) – miniaturisierte und automatisierbare Analyse-Plattformen mit hoher paralleler Testkapazität – sind zu wertvollen Werkzeugen in der biomedizinischen Forschung und Anwendung geworden. Eines der Haupteinsatzgebiete für Microarrays sind Genexpressionsanalysen. Wegen der Komplexizität dieser Multi-Parameter-Genaktivitätsstudien und wegen hoher Anfangsinvestitionen sind die Einstiegshürden in die Microarray-Technologie derzeit hoch. Eine Einstiegshilfe bieten Microarrays, die von kompetenten Anbietern nach kundenspezifischen Wünschen gefertigt werden (Custom Chips) oder als Fertigchips auf bestimmte Anwendungsgebiete zugeschnitten sind (z.B. ConceptArraysTM). In Kombination mit einem kundenorientierten „Expression Profiling Service“, der nach Wunsch einige oder alle Einzelschritte von der Versuchsplanung bis zur Datenauswertung abdeckt, wird es akademischen und industriellen Anwendern möglich, die Microarray-Technologie mit ihrem enormen Potential für sich zu erschließen und zu nutzen. Key Words: Microarrays, Biochips, Genexpressionsanalysen, ConceptArraysTM, Expression Profiling Service, Toxikologie, Krebsforschung Für die simultane Expressionsanalyse einer Vielzahl von Genen sind Microarrays (Biochips) die idealen Hochdurchsatzwerkzeuge. In einem biologischen System liefern Ver-

gleichsstudien zwischen den Genaktivitätsprofilen eines Testzustands und eines Kontrollzustands (Vergleichspaare z.B. krank/ gesund oder behandelt/unbehandelt) wich-

Abb. 1: Der experimentelle Ablauf einer ZweiFarb-Genexpressionsanalyse auf Microarrays

tige Aussagen zum Grundverständnis von Zellen und Organismen, zur zellulären Antwort auf Umweltfaktoren wie Fremd- und Giftstoffe und zur Diagnose und Therapie von Krankheiten1,2. Allerdings handelt es sich bei der Microarray-Technologie um ein sehr anspruchsvolles Verfahren, das in der Planungs-, Umsetzungs- und Auswertungs-

Anzeige

38 | Nr. III/2002

|transkript LABORWELT

B

L

I

T

Z

L

I

C

H

T

phase ein hohes Maß an fachlicher Kompetenz und für die experimentelle Durchführung eine Ausstattung mit Spezialgeräten wie Printern und Readern erfordert. Um Wissenschaft und Industrie einen problemlosen Zugang zur Microarray-Technologie zu ermöglichen und eine fundierte Entscheidungsgrundlage zu schaffen, bietet die Firma GeneScan ein Voll-Service-Konzept an, das alle Phasen der Chipherstellung und Genexpressionsanalytik abdeckt.

Spezialgefertigte Custom Chips und standardisierte ConceptArraysTM Als Microarray-Plattform im GeneScan-Serviceangebot (Abb. 1) dienen einerseits maßgeschneiderte „Custom Chips“, die spezifisch für die Fragestellungen und Wünsche von individuellen Anwendern aus der Wissenschaft („ScienceChips“) und Industrie („BusinessChips“) konzipiert und hergestellt werden. Andererseits werden themenspezifische Anwendungschips der ConceptArrayTM-Serie angeboten, die derzeit bekannte relevante DNA-Sonden aus einem bestimmten Forschungs- oder Anwendungsbereich auf einem vorkonfigurierten Microarray vereinigen. Das Spektrum wird ständig erweitert und reicht bereits von der Krebsforschung (CancerChip) und Untersuchung von akuten und chronischen Entzündungsprozessen (InflameChip) bis hin zu toxikologischen Fragestellungen (ToxChip). Alle Biochips der ConceptArrayTM-Serie enthalten als Informationsträger vorsynthetisierte und chemisch an einen Glasträger gekoppelte Oligonukleotide. Im Gegensatz zu cDNA-Sonden, die als PCRProdukte auf den Chip gespottet werden, bieten Oligonukleotide beim Sondendesign die Möglichkeit, die Sequenz durch Datenbankrecherchen gegen das gesamte bekannte Transkriptom abzugleichen und so maximale Spezifität zu erreichen3. Auf diese Weise können unerwünschte Kreuzhybridisierungen vermieden werden, und es kann sogar gezielt zwischen hochhomologen Mitgliedern von Multigenfamilien unterschieden werden. Alle Chip-gebundenen Oligonukleotide sind normalisiert für die Hybridisierungsbedingungen. Außerdem sind sie mit 50 Nukleotiden Länge, einem ansynthetisier-

Anzeige

Abb. 2: Zwei-Farb-Genexpressionsexperiment auf einem ToxChip. HepG2Zellen wurden mit CdCl2 behandelt (Testzellen) oder blieben unbehandelt (Kontrollzellen). Die aus beiden Zelltypen isolierte mRNA wurde während der reversen Transkription entweder mit dem Farbstoff Cy3 (grün) oder mit Cy5 (rot) markiert und auf dem Chip cohybridisiert. a) Identische Chipausschnitte von drei verschiedenen Hybridisierungsvarianten. Links: Testzellen Cy3/Kontrollzellen Cy5; Mitte: Testzellen Cy3/Testzellen Cy5, Rechts: Testzellen Cy5/Kontrollzellen Cy3. b) Gesamtchip, aus dem der auf dem mittleren Bild gezeigte Ausschnitt stammt

Kennziffer 28 LW 03 oder www.biocom.de
Info ordern?
|transkript LABORWELT

Nr. III/2002 | 39

B

L

I

T

Z

L

I

C

Abb. 3: Hierarchische Cluster-Analyse einer Genexpressions-Zeitkinetik nach CdCl2-Behandlung. HepG2 Zellen wurden 30 Minuten in Anwesenheit von CdCl2 behandelt und nach Mediumwechsel zu den angegebenen Zeiten für die Genexpressionsanalyse aufgearbeitet. Kontrollzellen blieben unbehandelt. In der Clusteranalyse der zugrundeliegenden Zwei-Farb-Experimente repräsentieren rote horizontale Linien CdCl2-induzierte Gene im zeitlichen Verlauf. Die Ausschnittvergrößerung auf der rechten Seite zeigt in der hierarchischen Anordnung den Bereich der Gene mit den höchsten Induktionsfaktoren.

ten Spacer und der chemischen Modifikation für die Oberflächenkopplung an das Trägermaterial optimal an die Verwendung auf der Microarray-Plattform angepaßt. Durchgängig tragen ConceptArraysTM integrierte positive und negative Kontrollen sowie die Sonden des ArrayFit-Systems4 zur Datennormalisierung bei Zwei-Farb-Genexpressionsanalysen.

Einsatzgebiete von ConceptArraysTM Krebserkrankungen zeigen ein vielschichtiges, multifaktorielles Krankheitsbild mit komplexen Genaktivitätsmustern, die mit bestimmten Krebsstadien oder Krebstypen assoziiert sind5. Sogenannte Cluster-Analysen tragen dazu bei, Gene zu finden, die gemeinsam an- oder abgeschaltet werden und daher möglicherweise über dieselben Regulationsmechanismen und Signalwege in der Zelle gesteuert werden. Das Ziel der biomedizinischen Genexpressionsanalysen auf Microarrays ist es, Krankheitsmuster zu erkennen, Tumortypen molekular zu klassifizieren und Vorhersagen über Krebsrisiken, Krankheitsverläufe und richtige Therapieansätze zu treffen. Letztendlich sollen Krebserkrankungen frühzeitig und exakter diagnostiziert und neue Therapien im Kampf gegen den Krebs entwickelt werden. Microarrays erlauben in einem einzigen Analysegang Aussagen über die Genaktivitätsmuster von Zellen nach Einwirkung von Fremdstoffen (Xenobiotika), Schadstoffen oder Giften und sind daher in allen Bereichen einsetzbar, in denen toxikologische Untersuchungen durchgeführt werden6. Das ist bei der Wirkstoffsuche und -entwicklung in den präklinischen Tests der pharmazeutischen Industrie der Fall. Dort ist die Evaluierung der Toxizität von Wirkstoffen ein zeitaufwendiger, kostenintensiver und geschwindigkeitsbestimmender Schritt. Auch die toxischen Potentiale von Zusatz- und Inhaltsstoffen in der Lebensmittel- oder Kosmetikin40 | Nr. III/2002

dustrie sowie von Schadstoffen in der Umweltbiotechnologie könnten durch Biochipgestützte Screening-Verfahren in Zellkultursystemen effizienter und umfassender abgeschätzt werden. Da bisher viele Arzneimittel, Kosmetika oder Umweltstoffe routinemäßig am lebenden Tier getestet werden, können Screening-Verfahren in Zellkulturen dazu beitragen, die Zahl der Tierexperimente einzuschränken.

„Expression Profiling Service” Trotz der offensichtlichen Vorteile von Microarrays liegen die Hürden für den Einstieg in diese relativ neue Technologie hoch. Kundenorientierte Voll-Service-Angebote ermöglichen auch Firmen, deren Kernkompetenz nicht auf dem Gebiet der Molekularbiologie liegt, den Zugang zu Genexpressionsanalysen auf Microarrays. Der „Expression Profiling Service“ von GeneScan ist ein flexibler, modular aufgebauter Komplettservice, der alle Schritte der Versuchsplanung, experimentellen Umsetzung und Datenauswertung abdeckt. Ganz nach Wunsch und eigenen Möglichkeiten kann der Interessent jedes Durchführungsmodul selbst bearbeiten oder aber in Auftrag geben. Im Extremfall ist noch nicht einmal ein eigenes Labor notwendig, denn selbst die Zellkulturexperimente für toxikologische Untersuchungen werden als Auftragsdienst übernommen. Die experimentellen Schritte einer Zwei-FarbGenexpressionsanalyse sind in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen zwei ToxChip-Analysen von Cadmium-behandelten Zellen als Anwendungsbeispiele. Das Schwermetall Cadmium wirkt als Zellgift und löst eine oxidative Streßantwort aus, in deren Verlauf hauptsächlich Gene angeschaltet werden, deren Proteinprodukte für die Wiederherstellung der normalen Zellfunktionen verantwortlich sind (Redox-Regulationsenzyme, Hitzeschock-Proteine, Chaperone).

H

T

Zur effektiven Verarbeitung und Auswertung der enormen Datenfülle hat GeneScan das DataBridge-Konzept zur online-Bereitstellung und interaktiven Auswertung der gewonnenen Microarray-Daten entwickelt. Der Anwender hat per Internet Zugriff auf seine Daten, die er mit der bereitgestellten Software (auch übergreifend) auswerten und grafisch darstellen kann. Besonders hervorzuheben ist die Möglichkeit des „online coaching“, das heißt der direkten Betreuung durch einen Bioinformatiker des Unternehmens, der über eine Internetverbindung mit dem Anwender interaktiv am gleichen Datensatz arbeitet. Hinter dem „Expression Profiling Service“ steht GeneScans langjährige Erfahrung in der Entwicklung, Herstellung und Anwendung von Microarrays. Alle Einzelprozesse sind optimiert, standardisiert und folgen den Regeln des Qualitätsmanagements, was maximale Effizienz, Datensicherheit und Reproduzierbarkeit gewährleistet. Custom Chips und Custom Service bieten Anwendern aus Wissenschaft und Industrie die Möglichkeit, das Potential von Genexpressionsanalysen auf Microarrays für ihre spezifischen Fragestellungen auszuloten und auf dieser Erfahrungsbasis fundierte Entscheidungen über den Einstieg in die MicroarrayTechnologie zu treffen. Je nach Probenaufkommen, laborspezifischen Voraussetzungen und apparativen Gegebenheiten kann das Beauftragen eines Dienstleisters (Outsourcing) oder die Etablierung der Technologie im eigenen Labor die wirtschaftlichere Lösung sein.

Literatur [1] Lockhart, D.J., Winzeler, E.A., Nature 405 (2000), 827-836. [2] Young, R.A., Cell 102 (2000), 9-15. [3] Kane, M.D., Jatkoe, T.A., Stumpf, C.R., Lu, J., Thomas, J.D., Madore, S.J., Nucleic Acids Research 28 (2000), 4552-4557. [4] Vonderstrass, S., Hallensleben-Steen, W., Bioforum 4 (2002), 189-190. [5] Alizadeh, A.A., Eisen, M.B., Davis, R.E., Ma, C., Lossos, I.S., Rosenwald, A., Boldrick, J.C., Sabet, H., Tran, T., Yu, X., Powell, J.I., Yang, L., Martl, G.E., Moore, T., Hudson, J., Lu, L., Lewis, D.B., Tibshirani, R., Sherlock, G., Chan, W.C., Greiner, T.C., Weisenburger, D.D., Armitage, J.O., Warnke, R., Levy, R., Wilson, W., Grever, M.R., Byrd, J.C., Botstein, D., Brown, P.O., Nature 403 (2000), 503-511. [6] Pennie, W.D., Toxicology Letters 112-113 (2000), 473-477.

Korrespondenzadresse Michael Gismann BioChip Technologies GmbH – ein Unternehmen der GeneScan Gruppe Engesserstraße 4 79108 Freiburg Tel.: 0761-5038 131, Fax: 0761-5038 166 eMail: [email protected] www.genescan.com |transkript LABORWELT

B

L

I

T

Z

L

I

C


Produkte & Service

DNA-Microarrays – Werkzeuge für die Molekulare Medizin Dr. Lutz Wehmeier und Dr. Sabine Ott, MWG-BIOTECH AG, Ebersberg DNA-Microarrays haben sich zu einem unentbehrlichen Werkzeug für die Untersuchung von GenExpressionsprofilen in der Pharmakogenomik, Toxikogenomik, Entwicklungsbiologie, Krebsforschung und vielen anderen Forschungsrichtungen entwickelt. Die Auswirkungen von Krankheiten, Umweltfaktoren, Therapeutika und vielen anderen Effekten auf die Expression mehrerer tausend Gene können mit Hilfe der Microarray-Technologie parallel analysiert werden. So lassen sich zum Beispiel die Expressionsprofile von Tumorzellen mit denen gesunder Zellen vergleichen und daraus eine Aussage über die Regulation tausender Gene ableiten. Mit Hilfe der gewonnenen Daten ist es möglich, Ursachen von Erkrankungen, Einflüssen von Umweltfaktoren oder Effekten von Therapeutika kosteneffizient und schnell zu erforschen.

Komplette Produktpalette MWG Biotech bietet Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Microarrays eine umfassende Palette an Applikationslösungen in höchster Qualität und Reproduzierbarkeit. Von hochdichten Catalog-Arrays verschiedener eukaryotischer und prokaryotischer ModellOrganismen, über kundenspezifische Custom-Arrays bis hin zu Oligonukleotid-Sets zur Eigenfertigung von Microarrays. Die hochdichten Catalog-Arrays, wie etwa der 30.000 Gene umfassende MWG Human 30K Array, werden meist für ein Erst-Screening eingesetzt, das heißt, es wird die Expression aller menschlichen Gene in einem bestimmten Zustand der Zelle untersucht. Dies geschieht meist in Form einer Cohybridisierung, also dem direkten Vergleich der Expression in zwei unterschiedlichen Zu-

ständen, wodurch in der Regel eine überschaubare Anzahl differentiell regulierter Gene ermittelt wird. Diese sind für den Forscher für weitere Analysen von Interesse.

H

T

Hier gewährleistet MWG Biotechs Custom Array-Service die individuelle Zusammenstellung interessanter Gene jedes pro- oder eukaryotischen Organismus auf einem speziellen Custom-Array. Die so mögliche Reduktion von 30.000 Genen auf die etwa 2 bis 300 wirklich interessanten Gene ermöglicht es dem Forscher, schnell, kosteneffizient und mit einer überschaubaren Menge an Daten eine große Anzahl von Zellen, Zuständen, Therapeutika o.ä. durchzutesten. Sofern ein eigenes Instrumentarium zur Arrayproduktion zur Verfügung steht, ist es möglich, alle oder individuelle Oligonukleotid-Sonden der MWG Catalog Arrays als Oligoset zu bestellen und selbst Arrays zu spotten. Werden Oligo-Sets für Organismen benötigt, für die noch keine Catalog Arrays vorliegen, so bietet die MWG-Biotech AG kompletten Design- und Synthese-Service für die speziellen gewünschten Gene an. Hierzu greift das Unternehmen auf seine hohe Bioinformatik-Kompetenz und jahre-

Abb. 1: Chip-Herstellung bei MWG-Biotech AG

 Info ordern?  Kennziffer 29 LW 03 oder www.biocom.de

Anzeige

|transkript LABORWELT

Nr. III/2002 | 41

B

L

I

T

Z

L

I

C

lange Expertise als europäischer Marktführer in der Oligonukleotidsynthese zurück, so daß Aufträge schnell und effizient nach MWG-Biotechs bewährter Ein-Gen/EinOligo-Methode hergestellt werden können.

Die Catalog- und Customarrays von MWG Biotech basieren auf hochreinen HPSF®-Oligonukleotid-Sonden mit einer Länge von 50 Nukleotiden. Zahlreiche Studien zeigen, daß 50mere eine optimale Balance zwischen Sensitivität und Spezifität darstellen. Zudem ist bei dieser Länge noch eine Qualitätskontrolle über Massenspektrometrie möglich, was Array-Oligonukleotide in voller Länge garantiert (siehe LABORWELT 2/2000). Die Oligonukleotide werden mit einer Aminomodifikation versehen und auf epoxybeschichtete Glasobjektträger gedruckt. Alle Schritte der Arrayentwicklung - von der Bioinformatik über die Oligonukleotidsynthese bis hin zur Herstellung der Arrays – finden bei MWG-Biotech statt.

Bioinformatik MWG Biotech besitzt eine leistungsstarke Bioinformatik-Abteilung, die es ermöglicht, auch ausgefallenen Kundenwünschen ge-

Abb. 3: Auswertung von DNA-Microarrays

recht zu werden: von der Annotation generierter Sequenzdaten über spezielle Bioinformatikfragen bis hin zum hochspezifischen Oligonukleotid-Design für Arrays. Beim Design der Arrays werden zunächst Oligonukleotide bestimmt, die aufgrund ihrer physikalischen Parameter wie GC-Gehalt und Schmelztemperatur (TM) geeignet sind und weder Sekundärstrukturen ausbilden noch „Self-Annealing” zeigen. Diese Oligonukleotide durchlaufen dann intensive BLAST- und Smith-Waterman-Analysen gegen die komplette Sequenz des entsprechenden Organismus, um Kreuzhybridisierungen auszuschließen. Die Basis dafür stellen proprietäre, nicht-redundante und speziesspezifische CodeSeq®-Datenbanken dar. Weiterhin ist die MWG-Bioinformatik in der Lage, ein hochspezifisches und statistisch zuverlässiges Oligonukleotid-Design von einem Oligonukleotid pro Gen zu garantieren. Dies hilft, die Auswertung des Arrays stark zu vereinfachen und die Datenmenge erheblich zu reduzieren. Auch spezielle Fragestellungen, wie die Detektion von Splice-Varianten oder die kundenorientierte Positionierung der Oligonukleotide, werden beim Design berücksichtigt.

Custom-Arrays Im Anschluß an ein Screening mit Catalog Arrays bietet MWG Biotech die Möglichkeit, speziellere Fragestellungen mit einem individuellen Kunden-Array zu beantworten. Dazu werden die aus einem Screening oder aus der Literatur ermittelten Gene auf einen persönlichen Customarray gebracht, der auf die speziellen Fragestellungen des Kunden zugeschnitten ist.

Abb. 2: Chip-Herstellung bei MWG-Biotech AG 42 | Nr. III/2002

T

einem bestehenden Oligo-Set noch weitere Oligonukleotide hinzugefügt werden. Dadurch kann ein kundenspezifischer CustomArray stets auch über den aktuellen Zeitpunkt hinaus noch an spezielle Anforderungen und Fragestellungen angepaßt werden.

Das DNA Microarray-Komplettprogramm ergänzen eine Vielzahl von Serviceleistungen der Bioinformatik, Workshops, wie auch Instrumente zur Chipherstellung und –auswertung, sowie Softwarelösungen.

Oligonukleotid-Technologie

H

Nach Einsenden der Genliste oder der Sequenzen entwirft MWG-Biotech innerhalb der kürzestmöglichen Zeit einen persönlichen Array. Das flexible Array-Design erlaubt es, nach der ersten Lieferung von Custom Arrays diese noch weiter zu modifizieren. So können beispielsweise Oligonukleotide ergänzt oder entfernt werden oder

Für alle Organismen in MWG-Biotechs Catalog Array-Portfolio kann mit Hilfe des Unternehmens-eigenen, Internet-basierten Compact Gene Index ein individuelles Subset von Genen - repräsentiert durch die für die MWG Catalog Arrays bereits entworfenen Oligonukleotide – zusammengestellt werden. Dieser Bioinformatik-Service wird auch für weitere wichtige Modellorganismen wie Zebrafisch, Arabidopsis und C. elegans auf der MWG-Website bereitgestellt werden. Mit einem umfassenden Produkt- und Serviceportfolio zum Thema DNA-Microarrays ist die MWG-Biotech AG damit in der Lage,

Abb. 4: MWG Human 30K Array mit 30.000 Genen des Menschen

schnell und kostengünstig applikationsorientierte und maßgeschneiderte Lösungen aus Produkt, Service und Instrument für hochspezifische Anforderungen zur Verfügung zu stellen. In Forschungs- und Technologiekooperationen sowie mit der Entwicklung von DNA-Microarrays zu spezifischen physiologischen und pathogenen Themenbereichen legt die Microarray-F&EAbteilung der MWG-Biotech AG zudem die Grundlagen für die Weiterentwicklung dieser wichtigen Werkzeuge in Richtung klinische Individualdiagnostik.

Korrespondenzadresse Ulrike Schramm Public Relations Manager MWG-BIOTECH AG Anzinger Straße 7a D-85560 Ebersberg Tel.: 08092-8289 929 Fax: 08092-8289 514 eMail: [email protected] www.mwg-biotech.com |transkript LABORWELT

B

L

I

T

Z

L

I

C


PCR

Hochdurchsatz-PCR, ein Werkzeug auf dem Weg vom Genom zum Expressionsprofil Patricia Langer, Markus Schuppler, Wolfram Hemmer; GATC Biotech AG, Konstanz Seit dem Anbruch der „Post-Genom-Ära“ wurden große Teile des Erbguts verschiedenster Organismen bereits entziffert. Einblicke in die von den DNA-Sequenzen determinierten zellulären Funktionsmechanismen ermöglicht die Untersuchung differentieller Gen-Expressionsprofile. Die DNA-ChipTechnologie gilt dabei heute als eine Schlüsseltechnologie: Charakteristische Gene, Gen-Abschnitte oder auch nicht charakterisierte Fragmente werden auf Arrays aufgebracht und stehen für verschiedenste Screening-Methoden zur Verfügung. Ein entscheidender Schritt auf dem Weg zum DNAArray oder DNA-Chip ist die Amplifikation der entsprechenden Gen-Abschnitte über Hochdurchsatz-PCR (HT-PCR). Key Words: automatisches Primerdesign, PCR im 96-Well-MTP Format, prokaryotische vs. eukaryotische Templates, cDNA-Banken als Templates, universelle vs. spezifische HT-PCR, Pipettierroboter/automatische Klon-Picker

Primer-Design und PCR im Hochdurchsatz Die Automatisierung der PCR beginnt bereits beim Computer-basierten Primerdesign. Mit Hilfe spezieller Software (z.B. Primer3) werden für beliebig viele Zielsequenzen Primer entworfen. Faktoren, wie die Größe der zu produzierenden PCR-Produkte und uniforme Annealing-Temperaturen der Primersätze, werden dabei automatisch berücksichtigt. Um störende Nebenprodukte zu vermeiden, können Parameter definiert werden, die die Spezifität der Primer bestimmen. Eine größtmögliche Effizienz der PCR wird durch die routinemäßige Prüfung der Sequenzen auf die Ausbildung von Haarnadelschleifen („Hairpins“), Homo- und Hetero-Oligomeren erreicht. Die so entworfenen HT-Primer werden schließlich im 96-WellMikrotiterplatten-Maßstab synthetisiert und für die PCR verwendet. Sofern nötig, werden die Standard-PCR-Bedingungen (eingesetzte Polymerase, Temperatur-Protokolle, MgCl2-Konzentration und andere Reaktionsbedingungen) den jeweiligen Ansprüchen angepaßt. Automatisierfähige Prozesse im Gesamtablauf können von Pipettier-Robotern durchgeführt werden. Optional kann auch eine anschließende Aufreinigung der PCR–Produkte im HT-Maßstab durchgeführt werden.

Projekt-Beispiele Abhängig von der individuellen Fragestellung unterscheiden sich bereits die Ausgangsmaterialien und damit die PCR-Templates. Dabei kann es sich beispielsweise um

H

T

die Generierung von Amplifikaten bakterieller „Open Reading Frames“ (ORFs), definierter eukaryotischer Gene über einen RTPCR-Ansatz oder ausgewählter Klone aus cDNA-Banken handeln. Um Expressionsprofile prokaryotischer Organismen zu untersuchen, werden zunächst im entsprechenden Genom mit Hilfe der Bioinformatik mögliche (putative) codierende Bereiche (ORFs) gesucht. Diese Zielsequenzen werden anschließend unter Verwendung spezifischer Primersätze mittels HT-PCR aus der genomischen DNA amplifiziert. Die fertigen PCR-Produkte können anschließend auf Filter oder andere TrägerMaterialien aufgebracht werden. Bei eukaryotischen Organismen können unterschiedliche Wege beschritten werden, um Informationen über das „Transkriptom“ – also die tatsächlich in einem Zelltyp, einem Gewebe oder einem Organismus exprimierten Gene – zu erhalten. Der erste Schritt ist stets die reverse Transkription der mRNA. Die gewonnene cDNA kann direkt als Template eingesetzt werden, um bekannte GenAbschnitte mit spezifischen HT-Primersätzen zu amplifizieren. Erfahrungsgemäß haben derartige Projekte, in denen mehrere hundert Gene amplifiziert werden sollen, eine Erfolgsquote von mehr als 80 %. Die Amplifikate können nun direkt auf Filter gespottet werden, die dann für Screening-

Abb. 1: Der Weg von der genetischen Information zum DNA-Chip führt in vielen Fällen über die Hochdurchsatz-PCR. Erläuterung siehe Text |transkript LABORWELT

Nr. III/2002 | 43

R Zwecke zur Verfügung stehen. Mit solchen Filtern lassen sich beispielsweise erste Evaluierungsschritte für einen geplanten Einsatz der Amplifikate auf Microarrays durchführen. Bisher unbekannte Transkripte können durch den Einsatz von normalisierten oder subtrahierten cDNA-Banken als Ausgangsmaterial identifiziert werden. In solchen optimierten cDNA-Banken sind seltene oder gewebespezifische Transkripte stark angereichert1. Mit Hilfe automatischer Klon-Pikker werden aus den primären Banken zunächst arrangierte Klon-Bibliotheken im 96oder 384-Well-MTP-Format erstellt. Diese können dann im Hochdurchsatz sequenziert werden, um eine gezielte Auswahl für die weitere Bearbeitung treffen zu können. Interessante Klone werden dann mittels automatisiertem „Hit Picking“ in neuen MTPs (Subset-MTPs) rearrangiert. Auf der Grundlage der Sequenzdaten können wiederum spezifische HT-Primersätze generiert werden, um aus definierten Subsets der KlonBibliotheken Amplifikate zu erzeugen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, daß zunächst ohne Vorauswahl Klone einer optimierten cDNA-Bank für einem Array verwendet werden: Zur universellen Amplifikation der subklonierten cDNA können Primer eingesetzt werden, die an flankierende Vektor-Sequenzen binden. Die Klone einer arrangierten Bibliothek im MTP-Format werden dann als automatisch pipettierbare Templates einer HT-PCR mit besagten universellen Primern verwendet. Aufgrund der Kontaminationsgefahr, die bei einer universellen – und damit „unspezifischen“ – PCR oder bei der Lagerhaltung der Klone grundsätzlich besteht, ist jedoch ein spezifischer (oder zumindest semi-spezifischer) Ansatz zu empfehlen. Aus welchem Ausgangsmaterial auch immer die Amplifikation erfolgt, das Spotten von PCR-Produkten auf Filter oder andere Träger hat gegenüber dem Aufbringen von Bakterienkolonien den entscheidenden Vorteil, daß ausschließlich die gewünschte DNA-Sequenz aufgebracht wird. Der bei einer Koloniehybridisierung auftretende unspezifische Hintergrund und damit die Anzahl der falsch-positiven Signale in Screening-Verfahren wird so deutlich reduziert.

Literatur [1] Gradl G. et al., BIOspektrum, 2002, 5/02, in press

Korrespondenzadresse Dr. Patricia Langer GATC Biotech AG Jakob-Stadler-Platz 7 78467 Konstanz Tel:. 07531-81 60 68 eMail: [email protected] www.gatc-biotech.com 44 | Nr. III/2002

E

P

O

R

T


Technologie

DNA- und Protein-Microarrays – Höchste Empfindlichkeit durch Planare Wellenleitertechnologie Dr. Michael Pawlak, Michael Schneider, Dr. Eginhard Schick, Dr. Gerhard M. Kresbach und Dr. Markus Ehrat, Zeptosens AG, Witterswil, Schweiz Die Ansprüche an die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und den Durchsatz von MicroarraySystemen nehmen seit einigen Jahren kontinuierlich zu. Die von Zeptosens für Microarray-Anwendungen weiterentwickelte Planare Wellenleitertechnologie ermöglicht einen bedeutenden Schritt zur Erfüllung dieser Ansprüche. Basierend auf dieser Technologie hat Zeptosens neue Produkte unter den Handelsnamen SensiChipTM und SensiChipTM Reader für DNA-Microarrays sowie ZeptoCHIPTM und ZeptoREADERTM für Protein-Microarrays kommerzialisiert. Die Planare Wellenleitertechnologie erlaubt – in Kombination mit signifikanten Verbesserungen der Oberflächenchemie, der Mikrofluidik, der Assaydurchführung, der neu entwickelten Auslesetechnologie und der Bildauswertung – eine zuverlässige und vollautomatische Messung von bis zu 300 Microarrays in einem analytischen Lauf. Dabei kann jeder dieser Microarrays mit bis zu einigen hundert Erkennungselementen zur Detektion von wenigen hundert bis tausend Kopien von Genen und Proteinen in höchster Präzision ausgestattet sein. Die Empfindlichkeit des Systems erlaubt es dabei, ohne eine enzymatische Signalverstärkung zu arbeiten. Key Words: DNA-Microarrays, Protein-Microarrays, PWG, Planare Wellenleitertechnologie, Planar Waveguide Technologie, ZeptoREADERTM, SensiChipTM Reader, ZeptoCHIPTM, SensiChipTM Die mit der Genom- und Proteomforschung aufgeworfenen wissenschaftlichen Fragestellungen haben die Entwicklung neuer ultraempfindlicher und schneller analytischer

Abb. 1: Grundlegende biologische Prozesse und Regulationsmechanismen der eukayotischen Zelle. Hochsensitive und parallel arbeitende Analysetechniken wie Microarrays sind notwendig, um die komplexen Steuer- und Regulationsmechanismen simultan zu erfassen.

Hochdurchsatz-Technologien vorangetrieben. Die 2001 in einem ersten Schritt abgeschlossene (Roh-)Sequenzierung des menschlichen Genoms1,2 und die darauf basierenden Analysen zeigten rund 30.000 bis 40.000 codierende Gene. Diese dienen – wenn man die verschiedenen Splicing- und Polyadenylierungsvarianten berücksichtigt – als Bauplan für einige 100.000 verschiedene Proteine. Informationen über diese Vielzahl von Genen und Proteinen können nur mit Methoden gewonnen werden, die mehrere hundert Gene oder Proteine parallel aus einer

kleinen Probe messen können. Neben den seit einiger Zeit eingesetzten DNA-Microarrays oder etablierteren Techniken wie 2DGel-Elektrophorese, Western Blots und MALDI-Massenspektrometrie gewinnen Protein-Microarrays immer mehr an Bedeutung für die parallele Analyse einer großen Anzahl verschiedener Wirk- und Markersubstanzen. Während sich die Funktionelle Genomik mit dem Zusammenspiel und der Regulation der unterschiedlich exprimierten Gene beschäftigt, ist es das Aufgabengebiet der „Funktionellen Proteomik“, die Regelmechanismen auf dem sehr viel breiteren und komplexeren Gebiet der Protein-Expression und der Protein-Ligand-Wechselwirkung zu erforschen und zu verstehen. Beide Themengebiete befassen sich sowohl mit der Aufrechterhaltung der internen Steuerung wie auch mit der Reaktion auf interne oder externe Störungen zellulärer Regelmechanismen – sei es durch Krankheit oder durch Gabe pharmakologisch oder xenobiotisch wirksamer Substanzen. Beiden Bereichen ist gemein, daß die regulatorischen Biomoleküle typischerweise in sehr geringen Konzentrationen vorkommen – bis hinab zu wenigen Kopien pro Zelle („low abundant genes“ bzw. „low abundant proteins“). Bei der Proteomik kommt erschwerend dazu, daß die Zielmoleküle unterschiedlich modifiziert (z.B. phosphoryliert oder glykosyliert) und in verschiedenen Aktivitätszuständen vorliegen können. Das Wissen, welches Protein in welcher Menge, in welchem Aktivitätszustand, an welcher Position in welchem Signaltrans|transkript LABORWELT

R

E

P

Abb. 2: Aufbau und Detektionsprinzip eines Planaren Wellenleiters: Ein zu einer Linie aufgefächerter Laserstrahl wird mit Hilfe eines Beugungs-Gitters in die hochbrechende Schicht eines Wellenleiterchips eingekoppelt. Das starke oberflächennahe evaneszente Lichtfeld regt nur oberflächengebundene Bindungskomplexe zur Fluoreszenz an und liefert damit höchste Empfindlichkeit.

O

R

T

Anzeige

duktionsweg und in welchem Zusammenhang mit einem Krankheitszustand steht, ist sowohl für die Auswahl von potentiellen Wirkstoffgruppen, die Pharmaentwicklung als auch die Diagnostik bedeutend. Dieses Wissen führt zur Definition von Markermolekülen – biologischen Substanzen, die von hoher Aussagekraft für bestimmte Vorgänge und Mechanismen in Organismen sind und die zur Beschreibung komplexer Systeme dienen (Abb. 1).

Praxisanforderungen In einer eukaryotischen Zelle befinden sich ungefähr 100 bis 500 Femtogramm (fg) mRNA. Diese mRNA-Population unterteilt sich in drei Gruppen: ca. 0,1 % mit großer (>1000 pro Zelle), rund 5 % mit mittlerer und etwa 95 % mit sehr geringer Kopienzahl (< 10 pro Zelle). Bei exprimierten Proteinen ist die Streubreite von geringer und sehr hoher Konzentration in einer Zelle oft noch größer. Damit gewinnt der Faktor Selektivität – die Möglichkeit des Erkennens einzelner Molekülpopulationen in komplex zusammengesetzten biologischen Matrices – sehr an Bedeutung. Steht nur wenig Probematerial zur Verfügung – wie zum Beispiel beim Gewinnen ausgewählter Einzelzellen mit Laser-Mikrosektion (Laser Capture Microdissection, LCM), der minimal invasiven Nadelbiopsie oder bei der dreidimensionalen Tumoruntersuchung zur Abgrenzung von gut- und bösartigen Geweberegionen –, steigen die Anforderungen an die Leistungsfähigkeit des Analysensystems beträchtlich. Wegen mangelnder Empfindlichkeit konnte bis heute ein Großteil von Boten- und Signalstoffen nicht oder nur nach aufwendiger enzymatischer oder chemisch-physikalischer Verstärkung detektiert werden – oft um den Preis ungenauer oder fehlerhafter Ergebnisse.

Gesteigerte NachweisEmpfindlichkeit mit SensiChipTM und ZeptoMARKTM Die höchstmögliche Nachweisempfindlichkeit der DNA- und Protein-Microarrays läßt sich nicht durch die Optimierung eines einzelnen Parameters erreichen. Wir haben – neben der Entwicklung der Planaren Wellenleitertechnologie als Basis zur hochempfindlichen und gleichzeitig robusten Fluoreszenzdetektion von Microarrays – eine Vielzahl weiterer Schlüsselfaktoren optimiert. Dies reicht von optimalen Herstellungsbedingungen bei der Produktion von Microarrays über die Verwendung spezieller Oberflächen, die bei minimaler unspezifischer Bindung die Erkennungselemente in einer möglichst nativen Form präsentieren, der Verwendung speziell |transkript LABORWELT

 Mehr Informationen ordern?  Faxseite: Kennziffer 30 LW 03

konstruierter Proben- und Reaktionsbehältnissen bis hin zur Optimierung von Assaybedingungen für die parallele Analyse einer Vielzahl von Erkennungsreaktionen bei gleichzeitiger Kompatibilität mit biologischen Matrices.

Planare Wellenleitertechnologie: Verwendung für Microarrays Im Gegensatz zu den üblicherweise im Bereich der Microarrays verwendeten Fluoreszenz-Scannern detektiert die in den ZeptosensSystemen eingesetzte Planare Wellenleitertechnologie (Planar Waveguide (PWG) oder Evaneszent-Feld-Technologie) nur die an die Oberfläche gebundenen Analyten und erzeugt keine Fluoreszenz in der darüber befindlichen Lösung. Damit werden Störsignale wie etwa ein starkes Hintergrundsignal durch fluoreszenzmarkierte, aber nicht gebundene Moleküle in der Lösung vermieden. Bei der PWG-Technologie wird monochromatisches Licht über ein Beugungsgitter in eine dünne transparente und hochbrechende Schicht aus Tantalpentoxid (Ta2O5) eingekoppelt, die auf ein Trägersubstrat aus Glas aufgebracht ist. Das evaneszente Feld wird durch Lichtleitung in dieser wellenleitenden Schicht erzeugt und hat in der hier verwendeten Konfiguration eine Eindringtiefe von einigen 100 nm in das umgebende wäßrige Medium. Die auf der Oberfläche gebildeten Biomolekülkomplexe befinden sich im Bereich des evaneszenten Feldes. Abbildung 2 zeigt schematisch den Aufbau eines Dünnschichtwellenleiters. Der ZeptoREADER™ und der im Aufbau ähnliche SensiChip™ Reader (zur Auslesung der DNA-Microarrays) sind mit LaserlichtNr. III/2002 | 45

R

E

P

O

R

croarrays, die jeweils mit einer individuell befüllbaren Mikrofluidik-Struktur versehen sind (Abb. 3a). Fünf dieser ZeptoCHIPsTM können in beliebiger Reihenfolge in einen ZeptoCARRIERTM eingesetzt werden, der die Abmessungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte besitzt, was die automatisierte Prozessierung der Microarrays, zum Beispiel durch Pipettierroboter, wesentlich erleichtert. Der ZeptoREADERTM (Abb. 3b) kann bis zu 10 ZeptoCARRIERTM aufnehmen und ermöglicht die vollautomatische Messung von bis zu 300 Microarrays in einem Arbeitsgang. Die Fluoreszenzsignale der individuellen Spots eines rund 5 x 7 mm großen Microarrays werden durch eine CCD-Kamera als Vollbild aufgenommen, also nicht durch Scannen. Die Belichtungszeiten können in einem weiten Bereich variiert werden, was das Erfassen sehr starker sowie sehr schwacher Fluoreszenzsignale ermöglicht. Die Bildanalyse und Auswertung erfolgt mit einer neuen, auf die speziellen Eigenschaften der ZeptoCHIPS™ und des ZeptoREADERs abgestimmten ZeptoVIEW™ Image Analysis-Software.

Abb. 3a: ZeptoCARRIER™ mit bis zu fünf ZeptoCHIPs™ im Außenformat einer Mikrotiterplatte. ZeptoCHIPs™ mit sechs Microarrays können über eine angebundene Mikrofluidikstruktur mit Probe- und Waschlösungen in Kontakt gebracht werden. Abb. 3b: ZeptoREADER™ Workstation: Lesegerät für bis zu 50 ZeptoCHIPs in 10 ZeptoCARRIER™. Damit können bis zu 300 Microarrays für einen Meßvorgang beladen und automatisch ausgelesen werden.

quellen zur Fluoreszenzanregung bei 635 nm („rot“) und 532 nm („grün“), sowie optional für die Protein-Microarray- Anwendungen bei 492 nm („blau“) ausgerüstet. Jeder ZeptoCHIPTM besteht aus sechs individuellen Mi-

Nachweis von einigen hundert Molekülen möglich Je nach Anwendungsgebiet und Versuchsbedingungen kann die PWG-Technologie im Vergleich zur Scannertechnologie Microarray-Bilder mit 50- bis 100fach besserem Signal/Rausch-Verhältnis liefern. Abbildung 4 zeigt am Beispiel eines Protein-Microarrays die mit PWG erreichbare, absolute Erfassungsgrenze für fluoreszenzmarkierte Proteine im Zeptomol-Bereich. Dazu wurde auf einem Chip ein Microarray mit Verdünnungen eines fluoreszenzmarkierten Proteins erstellt und im Scanner und dann im ZeptoREADER ausgelesen.

Capture- und Reverse Microarrays

Abb. 4: Bestimmung der Einzelspot-Detektionsgenzen (limit of detection, LOD) eines mit Cy5-Fluorophoren markierten Rinderserumalbumins (BSA) beladenen Microarrays. Es wurden jeweils fünf Spots einer Cy5-BSA-Verdünnungsreihe mittels Ink-Jet-Technologie auf den Chip aufgetragen. In einem Spot wurden 500 pl Lösung deponiert. Die LOD liegt bei der Spotreihe der 2 pM-Lösung. Dies impliziert, daß in einem Spot noch 1 Zeptomol markiertes Protein nachgewiesen werden kann. Dies entspricht ca. 600 Proteinmolekülen, mit einer durchschnittlichen Markierungsrate von 3 Fluorophoren pro Molekül. 46 | Nr. III/2002

Beim Design von Microarrays sind grundsätzlich zwei verschiedene Formate möglich: Capture-Microarrays und Reverse Microarrays. Bei Capture-Microarrays werden Erkennungselemente für ein ausgesuchtes Set zu untersuchender Zielmoleküle hergestellt und auf der Chip-Oberfläche als Spots aufgebracht. Bei DNA-Microarrays bestehen diese Erkennungselemente typischerweise aus cDNA beziehungsweise aus Oligonucleotiden in einer Länge zwischen ca. 14 und 90 Nucleobasen; bei Protein-Microarrays häufig aus mono- oder polyklonalen Antikörpern, exprimierten oder aufgereinigten Proteinen oder synthetisierten Peptid-Epitopen. Die Erkennung der Zielmoleküle in den aufgebrachten Lösungen (Gewebe- oder Zellextrakte, Seren, usw.) erfolgt durch hochselektive biospezifische Wechselwirkung. Die Detektion erfolgt bei DNA-Microarrays direkt über markierte DNA-Targetmoleküle; bei Protein-Microarrays wird der oberflächen-

T gebundene Analytkomplex üblicherweise durch Zugabe eines zusätzlichen zweiten fluoreszenzmarkierten Detektions-Antikörpers im Sandwich-Assay-Format nachgewiesen. Bei Reverse Microarrays werden Zell- oder Gewebeextraktproben, die Zellproteine als potentielle Analyten enthalten, in Form eines Arrays auf den Chip aufgebracht. Bei diesem Arraytyp werden die Analysenproben gespottet und anschließend in jeder Probe einer oder mehrer Analyten quantitativ bestimmt. Dies erfolgt mit einem analytspezifischen, fluoreszenzmarkierten Antikörper aus einer wäßrigen Lösung. Im Gegensatz zum Sandwich-Assayformat bei Capture-Microarrays wird beim Reverse Microarray nur ein Antikörper zur Detektion benötigt und damit der Aufwand deutlich reduziert, der mit der Herstellung hochspezifischer Antikörperpaare verbunden ist. Bei Reverse Microarrays ist eine hohe Empfindlichkeit der eingesetzten Detektionstechnologie besonders wichtig, da im Gegensatz zu den Capture-Microarrays keine Anreicherung der Analyten auf der Oberfläche erfolgt. Reverse Microarrays erlauben also die gleichzeitige Untersuchung einer großen Probenzahl auf die Anwesenheit eines oder mehrerer gesuchter Biomarker, wobei von jeder Probe nur kleinste Volumina eingesetzt werden müssen. Es stehen dabei generell alle Proteine des Zellproteoms als mögliche Analyten zur Verfügung.

DNA-Microarrays – der Zugang zu „verborgener“ Information Zeptosens stellt DNA-Microarrays mit bis zu 1.000 verschiedenen Genen pro Chip unter dem Markennamen SensiChipTM her. Diese werden mit dem dazugehörigen SensiChipTM Reader und der Auswertesoftware SensiChipTM View exklusiv vom Partnerunternehmen QIAGEN3 vertrieben. Unter Verwendung speziell angepaßter Pufferlösungen und Hybridisierungsbedingungen lassen sich auch niedrigst konzentrierte mRNAs („low abundant genes“) ohne enzymatische Verstärkung der Zielmoleküle wie etwa durch PCR oder T7 direkt aus Proben, die 1 µg Total-RNA enthalten, messen und damit mögliche Fehler durch die Verstärkung vermeiden (Abb. 5).

Protein-Microarrays4-6 Im Gegensatz zu DNA-Microarrays, bei denen nur eine einzige Molekülklasse auf der Chipoberfläche immobilisiert wird, ist die Variationsbreite möglicher – zur biomolekularen Erkennung nutzbarer – Moleküle bei den Protein-Microarrays sehr viel breiter. Eine besondere Herausforderung besteht darin, die Vielfalt an unterschiedlich stabilen Proteinspecies von Antikörpern über Peptide, Enzyme, bis hin zu sehr empfindlichen zellmembranständigen Rezeptoren auf der Chip|transkript LABORWELT

R

E

P

O

R

T

oberfläche in hoher und zugänglicher Dichte zu immobilisieren und sie gleichzeitig in einer möglichst funktionellen Form zu erhalten (Abb. 6). Für diese verschiedenen Anwendungsbereiche hat Zeptosens spezielle Oberflächen entwickelt, zum Beispiel auf Basis selbstorganisierender monomolekulerer Schichten (sogenannte self-assembled monolayers, SAM) aus Alkylphosphaten7. Diese monomolekularen Schichten sind sehr homogen und geordnet und können durch Funktionalisierung der Alkylenden an spezifische Anforderungen der Erkennungselemente angepaßt werden. Die Oberflächen erlauben es etwa, Proteine sowohl adsorptiv (z.B. Antikörper) als auch funktionell gerichtet (z.B. His-Tag-Proteine) auf der ausgewählten Chipoberfläche zu immobilisieren.

Abb. 5: Bestimmung der RNA-Expression aus etwa 100 ng mRNA (Maus). Links: Auswertung mittels PWG-Technologie. Rechts: Auswertung mit einem konventionellen Fluoreszenzscanner. Mitte: Gegenüberstellung der Intensitätsprofile.

A

B

Des weiteren werden Coploymere auf der Basis von Polyethylenglykol (PEG) und Polylysin verwendet, das beipielsweise endständige Biotingruppen trägt. Längenoptimiertes PEG garantiert einerseits die gute Zugänglichkeit der Biotingruppen und minimiert gleichzeitig die unerwünschte unspezifische Adsorption von Proteinen aus biologischen Matrices. Dies erlaubt sehr empfindliche und spezifische Messungen von Analyten aus Serum, Zell- oder Gewebeextrakten ohne große zusätzliche Aufreinigung. Die zielgerichtete optimale Anpassung einer Oberfläche an die speziellen Anforderungen eines Assays und der vorliegenden Matrix zeigt selbst bei der Messung mit konventionellen Scannern das große Potential der Verbesserung der Nachweisgrenzen auf (Abb. 7). Die Kombination einer optimierten Oberfläche mit der PWG-Technologie zeigt die vollen Möglichkeiten des Zeptosens-Verfahrens.

Antikörper-Microarrays – für die Expressionsanalyse und Validierung von Markerproteinen Antikörper-Microarrays werden benutzt, um parallel die Expression einer größeren Anzahl definierter Zielproteine zu erfassenso zum Beispiel von Markersubstanzen, die karzinogene Gewebeveränderungen, Veränderungen des Metabolismus oder toxische Effekte als Folge der Verabreichung pharmakologischer Wirksubstanzen widerspiegeln. Diese Messungen müssen schnell und effizient quantitative Aussagen – auch bei komplexen Matrices wie Serumproben aus präklinischen Studien – liefern und tragen entscheidend dazu bei, die Entwicklung neuer Medikamente ressourcensparender zu gestalten. Die Miniaturisierung herkömmlicher Mikrotiterplatten zu Microarrays erlaubt die Messung der Analyten auf mehreren CaptureSpots des Microarrays und damit eine erste statistische Mittelung der Resultate. Neben den spezifischen Capture-Antikörpern können auch Referenzproteine auf einen Mic|transkript LABORWELT

Abb. 6: Aufbauschemata von Zeptosens‘ Protein-Microarrays im Capture Array-Format: A. Antikörper-Array (links): Drei verschiedene Capture-Antikörper (drei Spotbereiche schematisch angedeutet in rot, grün, blau) adsorptiv aufgetragen auf einer hydrophoben ZeptoCHIP-Oberfläche; Messung (unten): Es können parallel mehrere „low abundance“-Marker (Signaltransduktionsmarker, Zytokine, usw.) gleichzeitig in einer Probe (z.B. Serum, Zelllysat) quantifiziert werden. Das Array wird inkubiert mit einer Mischung von markerhaltiger Probe und den Detektionsantikörpern für die selektierten Analyten (rot, grün, blau). B. Peptid-Array (oben): Drei verschiedene Peptidepitope (3 Spotbereiche schematisch angedeutet in rot, grün, blau) gerichtet und kovalent fixiert über ein Ankermolekül (Streptavidin) auf einer biotinylierten ZeptoCHIP-Oberfläche; Messung (unten): Es können eine Vielzahl von Seren auf epitopspezifische Antikörper hin untersucht werden. Das Array wird zuerst mit Serum inkubiert; nach einem Waschschritt wird ein fluoreszenzmarkierter Detektionsantikörper appliziert, der die Fc-Bereiche der Analytantikörper speziesspezifisch erkennt. In beiden Fällen (A) und (B) wird mittels eines Sandwich-Assay-Formates detektiert.

roarray aufgebracht werden, die Chip- und Geräte-spezifische Parameter sowie biologische Effekte der eingesetzten Proben berücksichtigen. Die Vielzahl von Referenzierungsmöglichkeiten erlaubt es, die Messungen sehr präzise durchzuführen und trotz der kleinen Probevolumina sehr zuverlässige Resultate zu erhalten. In Abbildung 8 werden die Er-

gebnisse einer Parallelbestimmung von mehreren Markern anhand der Signal-Dosis-Meßkurven und der Präzisionsprofile von drei Zytokinen in einer Fünffach-Bestimmung mit Zeptosens-Antikörperarrays gezeigt. Die Konzentrationsbestimmung geschieht durch den Vergleich mit Standardsignalkurven, die mit Hilfe definierter Mischungen der ver-

Abb. 7: Einfluß der Oberflächenchemie auf die Nachweisgrenzen – hier dargestellt als Detektionsgrenzen β für das Zytokin IL-1β Nr. III/2002 | 47

R

E

P

O

R

Abb. 8: ZytokinMicroarrays – Mehrfachbestimmung von Markersubstanzen in Serum.

schiedenen Analyten in unterschiedlicher Konzentration generiert wurden. Mit Hilfe dieses Verfahrens können diese Markersubstanzen für Entzündungsprozesse bis zu einer Konzentration von nur 1 bis10 pg/ml in Serum gemessen werden. Diese Microarrays zeichnen sich durch eine sehr geringe unspezifische Bindung der Nachweisantikörper, sehr schwache Hintergrundsignale, keine Kreuzreaktivitäten und eine sehr gute Reproduzierbarkeit der Spotsignale mit Variationen von 5 bis 10 % aus und erlauben deshalb sehr empfindliche Messungen auch in Anwesenheit von Serummatrix. Es kann davon ausgegangen werden, daß bei Vorliegen hochspezifischer Antikörper 20 Analyten mit derselben Präzision auf Microarrays gemessen werden können.

Peptid-Microarrays – für die Entwicklung neuer Impfstoffe Die richtige Identifizierung und Charakterisierung immunogener Peptidsequenzen ist ein wesentlicher Bestandteil bei der Entwick-

lung neuer Impfstoffe. Durch die Kombination neuer genomischer Ansätze mit effektiven, parallel arbeitenden Analysemethoden beim Screenen von Personenseren können solche Impfstoffe schneller gefunden und entwickelt werden. Peptid-Microarrays bieten eine Möglichkeit für eine effiziente Analyseplattform bei der Entwicklung solcher Impfstoffe (Zusammenarbeit mit Intercell AG, Wien8). Biotinylierte Peptid-Epitope werden über Anbinden eines spezifischen Ankermoleküls (z.B. Streptavidin) in Form von Microarrays auf Biotin-terminierte ZeptoCHIPsTM aufgebracht. Humanseren werden in Verdünnungsreihen mit den Peptidarrays inkubiert und so Bindungsprofile der serenspezifischen Antikörper gegen die oberflächenimmobilisierten Peptid-Epitope erstellt. Aus den Signalen nach Inkubation mit Verdünnungsreihen der Seren können die Titer der jeweiligen Serenantikörper bestimmt werden. Die von Zeptosens entwickelte Oberflächenchemie trägt wesentlich dazu bei, die spezifische Bindung und die Zugänglichkeit der Antikörper

T zu den Epitopen zu fördern. Durch die zusätzlich stark unterdrückte, unspezifische Bindung von Serumproteinen an die Chipoberfläche konnte eine sehr hohe Detektionsempfindlichkeit erreicht werden – teilweise bis zu Faktor 30 höher als in konventionellen Peptid-ELISAs. Diese Empfindlichkeit erlaubt es, auch sehr kleine relative Änderungen der Bindungsprofile nachzuweisen. Abbildung 9 zeigt typische Signalbilder einer Serumverdünnungsreihe (1:1000 bis 1:30000) auf einem ZeptoCHIP™ mit sechs Arrays. Aus den jeweiligen Verdünnungskurven wurden die Serumtiter für die entsprechenden Peptide ermittelt. Zur Zeit können bis zu 250 Peptide im Duplikat in die Zeptosens-Microarrays integriert werden.

Fazit Die von der Zeptosens AG entwickelte Kombination der Microarray-Technologie mit der Planaren Wellenleitertechnologie ermöglicht es, die für aussagekräftige Untersuchungen erforderlichen Mengen an biologischem Material und den damit verbundenen Aufarbeitungsaufwand deutlich zu senken. Die durch rein optische Prinzipien sowie durch konsequente Verfahrensoptimierung begründete Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit vermeidet die sonst oft mit chemischen oder biochemischen/molekularbiologischen Signalverstärkungsmethoden einhergehenden Signalverfälschungen.

Literatur [1] E.S. Lander et al., Initial sequencing and analysis of the human genome, Nature 409, 860–921 (2001) [2] J.C. Venter et al., The sequence of the human genome, Science 291, 1304-135 (2001) [3] SensiChipTM Array Detection System. www.qiagen.com [4] H. Zhu et al., Global Analysis of Protein Activities Using Proteome Chips, Science 293, 2101–2105 (2001) [5] M.F. Templin et al., Protein Microarray Technology, Trends Biotechnol. 20, 160-166 (2002) [6] M. Pawlak et al., Zeptosens’ protein microarrays: A novel high performance microarray platform for low abundance protein analysis, Proteomics 2(4), 383393 (2002) [7] M. Textor et al., Structural Chemistry on Self-Assembled Monolayers of Octadecylphosphoric Acid on Tantalum Oxide Surfaces, Langmuir 16, 3257 – 3271 (2000) [8] Intercell entwickelt prophylaktische und therapeutische Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten und Krebs. www.intercell.com.

Korrespondenzadresse

Abb. 9: Serie von sechs identischen ZeptoCHIP™ Peptid-Arrays, die mit unterschiedlichen Verdünnungen menschlichen Serums inkubiert wurden. Aus den Verdünnungskurven lassen sich die Titer der Seren für eine Vielzahl von Peptid-Epitopen gleichzeitig quantitativ bestimmen. Rechts gezeigt ist die Verdünnungskurve eines einzelnen Peptids. 48 | Nr. III/2002

Zeptosens AG Benkenstraße 254 CH-4108 Witterswil Tel.: +41-61-726 8181 Fax: +41-61-726 8171 eMail: [email protected] www.zeptosens.com |transkript LABORWELT

P

R

O

D

U

K

T

W

E

L

T


Kennziffer 33 LW 03


Kennziffer 35 LW 03

ArabidopsisMicroarray-Kit

Slides und Cus- Modifizierte Oligonukleotide tom-Arrays für Thermo Hybaid hat seine Palet- Darüber hinaus kann auf Kunte an fluoreszenzmarkierten Olidenwunsch – auch per onlinereproduzierbare gonukleotiden durch zwei Li- Order (Oligonukleotide) – fast zenz-Verträge komplettiert. Für den Bereich DNA-SequenzieDNA-Analysen rung bietet das Biotech-Unter-

Einen Microarray-Kit mit 14.800 spezifischen Sequenzen der Modellpflanze Arabidopsis thaliana aus öffentlichen Datenbanken haben die Unternehmen Agilent Technologies und Paradigm Genetics Anfang Juli vorgestellt. Der mit 60meren bestückte Standard-Objektträger ermöglicht ein genomweites High-Content-Screening.

Die aktivierten Glas-Slides der Picorapid GmbH für Microarray-Analysen eignen sich wegen ihrer außergewöhnlich homogenen Oberfläche nicht nur für den Einsatz in der For-


Kennziffer 34 LW 03

Neuer Protein Microarray-Kit FAST™ PAK 2 Mit dem neuen Protein Microarray Kit „Fast Pak 2“ von Schleicher & Schuell BioScience können jetzt zwei verschiedene Microarrays oder Proben auf einem einzigen Slide untersucht werden. Die Slides haben zwei getrennte Pads von 20 x 20 mm und die passenden Inkubationskammern (siehe Bild), was eine parallele Ergebnisauswertung ermöglich. Protein Microarrays auf FAST-Slides sind für

Original FAST Slide und Inkubationskammer (links). FAST PAK 2 Slides und Inkubationskammer (rechts)

mindestens 22 Monate stabil, wenn die Proben mit dem speziell entwickelten FAST PAK Array-Puffer aufgetragen werden. Durch die dreidimensionale Nitrocellulose-Beschichtung ist die Signalstärke und die Spot-Morphologie reproduzierbar – von Slide zu Slide und von Pad zu Pad. Der Kit kann in Kombination mit vorhandenen Arrayern und Scannern verwendet werden. Nachweise sind mit Fluoreszenz, Chemolumineszenz, Colorimetrie oder Radioaktivität möglich. |transkript LABORWELT

schung, sondern auch für diagnostische und bioanalytische Anwendungen. Die Isothiocyanat-aktivierte Oberfläche der PicoSlides™, auf der aminomodifizierte Oligonukleotide, cDNAs etc. kovalent fest gebunden werden, wird in einem standardisierten, qualitätskontrollierten Verfahren unter Reinraumbedingungen hergestellt. Mit einem speziellen Laserverfahren können PicoSlides™ mit einem Zahlen-, DataMatrix- oder Barcode versehen werden, der gegen Hybridisierungslösungen resistent ist. Pico-Slides™ bilden die Basis für Picorapids leistungsfähigen Custom-Array-Service (PicoArrays™). Ein zum Patent angemeldetes, kontaktfreies PiezoSpottingverfahren gewährleistet die Dosierung strikt standardisierter Volumina, was zu äußerst homogenen Spots führt, die eine präzise Signalquantifizierung ermöglichen. Zusammen mit der hohen Oberflächenqualität der PicoSlides™ wird so eine optimale Intraund Interarray-Reproduzierbarkeit erreicht. Das niedrige Hintergrundsignal und die hohe Bindungskapazität der Pico-Slides™ gewährleisten ein großes Signal-/Rauschverhältnis und höchste Sensitivität bei der Microarray-Analyse.


Kennziffer 36 LW 03

nehmen ab sofort Oligo-Markierungen mit den FluoreszenzFarbstoffen IRDye™700 und IRDye™800 der Firma Li-Cor, Inc. an. Ein weiteres Abkommen für die Real-Time-PCR wurde mit Biosearch Technologies, Inc. getroffen. Thermo Hybaid liefert als besondere Modifikation jetzt auch doppelt-markierte DNASonden mit den Black-HoleQuenchern BHQ1, BHQ2 und BHQ3. Damit bietet Thermo Hybaid mehr als dreißig StandardFarbstoffmodifikationen an.

jede Fluoreszenz-Markierung synthetisiert werden. Die Oligonukleotide sind RP-HPLCgereinigt und werden mit Qualitätszertifikat ausgeliefert.


Kennziffer 37 LW 03

SNP-Assays-on-Demand Funktionell validierte Assays speziell für das genetische Screening mit hohem Durchsatz hat das Unternehmen Applied Biosystems vor kurzem auf den Markt gebracht. Von positiven Erfahrungen berichtet Prof. Dr. Stefan Schreiber, Kieler Koordinator des Nationalen Genomforschungsnetzes, der die Assays zur Mutationsidentifizierung getestet hat: „Statt monatelang genomische Daten durchzugehen und eigene Assays zu entwickeln, konnten wir zwei bis drei Wochen nach Bestellung der Assays-on-

Demand mit unseren Studien beginnen.“

Bisher hat Applied Biosystems 77.000 Assays für die SNP-Genotypisierung und 9.200 Assays für die quantitative Genexpressionsanalyse freigegeben.


Kennziffer 38 LW 03

Non-enzymatic RNA labeling PerkinElmer Life Sciences has introduced a fast, easy-to-use RNA Labeling Kit. The MICROMAX ASAP RNA Labeling Kit is the only complete kit for direct labeling of RNA using novel non-enzymatic ULS (Universal Linkage System) technology for carrying out differential gene expression assays. Allowing researchers to investigate the in situ RNA instead of a copy unlike current direct enzy-

matic protocols incorporating cyanine nucleotides or the amino allyl enzymatic labeling protocols, MICROMAX ASAP provides a faster, less complex procedure, easily be carried out by first-time users. The MICROMAX ASAP RNA Labeling Kit (MPS544) contains enough labeling reagents and hybridization buffer for the dual fluorescence detection of 25 glass microarray experiments. Nr. III/2002 | 49

P

R

O

D

U

K

T

W

E

L

T


Kennziffer 39 LW 03

Protein-Microarrays ohne Chip-Spotter herstellen Die CHIMERA BIOTEC GmbH, Dortmund (www.chimerabiotec.de), hat mit der DDI-Technologie (DNA-Directed-Immobilization) eine innovative Plattform zur hochparallelen Immobilisierung von Proteinen entwickelt. Die DDI-Methode ermöglicht eine auf Selbstorganisation beruhende, sehr milde Kupplung beliebiger Proteine auf festen Substraten (Glas-, Kunstoff- oder Metalloberflächen), bei der die maximale biologische Aktivität der Proteine erhalten bleibt. Gegenüber herkömmlichen Methoden zur Protein-Immobilisierung ergeben sich eine ganze Reihe von Vorteilen. Mit der DDI-Technologie können Proteinarrays mit einem Kit-System ohne teuren Microarrayspotter vom Anwender selbst „just-in-time“ hergestellt werden. Das Kit enthält neben einem etablierten und gut lager-

Impressum Die Themenhefte LABORWELT erscheinen zweimonatlich im Verlag der BIOCOM AG Stralsunder Str. 58-59 D- 13355 Berlin Tel. 030/264921-50 Fax 030/264921-11 eMail: [email protected] Internet: www.biocom.de Redaktion: Andrea Schneider (Chefredaktion) Dipl.-Biol. Thomas Gabrielczyk Anzeigenleitung: Oliver Schnell Tel. 030/264921-45 eMail: [email protected] Leserservice: Tel. 030/264921-40 Graphik & Bildredaktion: Heiko Fritz Namentlich gekennzeichnete Beiträge stehen in der inhaltlichen Verantwortung der Autoren. Alle Beiträge sind urheberrechtlich geschützt. Ohne schriftliche Genehmigung der BIOCOM AG darf kein Teil in irgendeiner Form reproduziert oder mit elektronischen Systemen verarbeitet, vervielfältigt oder verbreitet werden. © BIOCOM AG, Berlin

50 | Nr. III/2002

baren DNA-Chip die zu immobilisierenden Proteine, die mit ausgewählten, zum Chip komplementären Nukleinsäure-Tags modifiziert sind. Hierdurch entfällt nicht nur die häufig proble-

matische Lagerung der empfindlichen Proteinchips, sondern die DDI-gebundenen Proteine besitzen wegen des Nukleinsäure-Linkers auch eine außergewöhnlich hohe Aktivität.

assays. Darüber hinaus wird die Produktlinie durch die Entwicklung kundenspezifischer Arrays abgerundet. Für die DDI-Technologie entwickelte CHIMERA eine neu-

artige Kupplungschemie für die Herstellung von DNA-Arrays mit extrem hoher Bindungskapazität. So übertreffen CHIMERAs 3D-Chips die Immobilisierungskapazität handelsüblicher Beschichtungen um ein Vielfaches und gestatten darüber hinaus die Regenerierung und damit die Wiederverwendung der DNA- bzw. DDI-Arrays ohne Verlust der Bindungskapazität. CHIMERAs 3D-Technologie wird neben den DDI-Kits auch in Form aktivierter Slides für Nukleinsäure- und Protein-Arrays vermarktet. In CHIMERAs Entwicklungspipeline befinden sich derzeit verschiedene Spezialapplikationen, beispielsweise maßgeschneiderte Oberflächen für Arrays aus lipophilen Membranproteinen für das Wirkstoffscreening.


Kennziffer 40 LW 03


Kennziffer 41 LW 03


Kennziffer 42 LW 03

Data Mining

Genotyping in a new light

geniom® one

CHIMERA entwickelt und vertreibt als weltweit einziger Anbieter standardisierte Kits zur Anwendung selbstorganisierender Antikörper-Arrays für parallelisierte Mikro-Immuno-

Immunoassay auf DDI-Basis: Oligonukleotid-markierte Antikörper werden an einem DNA-Chip immobilisiert (a) und für einen ELISA verwendet (b,c). Im Anschluß läßt sich der DNA-Chip regenerieren und für weitere Experimente verwenden.

Spezielle Anwendungsvorlagen für die Genexpressionsanalyse stellt der Software-Hersteller SPSS Science auf der BIODIGITAL 2002 in Freiburg vor (Halle 2, Stand 550). In die neue Version 7.0 der Data Mining-Software „Celementine“ ist ein spezieller „Clementine Microarray CAT“ optional eingebunden. Das Programm Clementine wird zur Untersuchung von Struktur/Aktivitäts-Beziehungen, ADME/Tox-Verhalten und Genexpressionsdaten eingesetzt. Das Programm soll neben der Clusteranalyse auch Voraussagen ermöglichen. Zur Erleichterung bestimmter Anwendungsroutinen bietet Clementine vorgefertigte Anwendungsvorlagen (CATs), die mit neuen Daten bestmögliches Data Mining ermöglichen. Der Microarray CAT führt durch die grundlegenden Schritte zur Analyse von Genexpressionsdaten – Datenvorbereitung, Feature-Selektion, Klassifizierung sowie Clustering und Visualisierung.

The new PSQ™HS 96A System from Pyrosequencing delivers cost-efficient genotyping of small amounts of sample DNA (typically 5-10µl of PCR product). Multiplexing reduces costs and increases throughput,

while in built automation supplies the system with up to ten plates from the integrated stacker. Efficiency is further improved with the new Vacuum Prep Tool, which delivers fast and simple sample preparation. In addition, as throughput needs increase, it will be possible to upgrade to a 384-format HS solution.

geniom® one integriert die Microarray-Produktion, Hybridisierung und Fluoreszenzdetektion. Standard- und CustomArrays mit individuellen Oligonukleotidsonden können innerhalb weniger Stunden durch in situ-Synthese in jedem Labor hergestellt und analysiert werden. Hochparallele Experimente zur Genexpression oder zur Genotypisierung lassen sich somit zeit- und kostensparend, flexibel und zuverlässig durchführen. Mikrofluidische Verfahren bewirken eine effektive Hybridisierung und minimieren den Verbrauch an Reagenzien und Probenmaterial. Die direkte Umsetzung von Sequenzdaten und Sonden in digitale Arrays ermöglicht, daß für alle sequenzierten Organismen Arrays selbst entwickelt und hergestellt werden können.

Kennziffer 31 LW 03
Info ?
|transkript LABORWELT