MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER I

MOLEKÜLER  BİYOLOJİDE   KULLANILAN  YÖNTEMLER  I

REKOMBİNANT  DNA   TEKNOLOJİSİ KLONLAMA

Genetik mühendisliği, Canlılarla ilgili temele ve uygulamaya ait sorunların çözülmesi için bir çok bilim dalına ait bilgilerin ve çeşitli tekniklerin birlikte kullanıldığı bir teknolojidir. Genetik mühendisliği, en geniş anlamda, insanlar tarafından belli bir amaca yönelik olarak genetik materyal üzerinde yapılan çalışmalar olarak tanımlanabilir.

Genetik  mühendisliğinin  katkıları: A. Bilimsel katkı. •

Moleküler biyolojinin gelişimi.

B. Uygulamalı alanlara katkı. •

Endüstri sektöründe kıymetli ürünlerin bol, saf ve ucuza eldesi.

•

Tıpta hastalıkların tanı ve tedavisi.

•

Tarım ve hayvancılıkta iyileştirme.

•

Çevre kirliliğinin önlenmesi vb.........

Organizmaların genleri üzerinde yapılan planlı işlemler ⇒ genetik analizlerin yapılması ⇒ istenilen özellikleri taşıyan canlıların geliştirilmesi

Genetik  Klonlamada  Tarihçe 8 Deniz  hayvanlarında  döllenme                                    O.Hertwig                                       1875 8 İlk  kez  anne  rahmi  dışında  döllenme                  L.Schenk                                                  1878 8 Tüp  ortamında  insan  yumurta   hücresi  döllendi.           MF  Menkin           1944 8 Dondurulmuş  sperm  ile  inek  yumurtası  döllendi.

1952

8 Deney  tüpünde  döllenen  bir  memeli  yavru  doğdu.                        1959 8 Dondurulmuş  embriyodan  yavru  fareler  elde  edildi.                    1972 8 Louise  Brown  isimli  bebek  deney  tüpünde  döllendi  anne  rahmine   yerleştirilerek  sağlıklı  doğum  yaptırıldı.                 1978 8 Avusturalyada  donmuş  embriyodan  sağlıklı  bir  kız  çocuğu  elde   edildi.                                                                                                                                         1984

Genetik  Klonlamada  Tarihçe 8 Kiralık  anne  Mary  Beth    bebeğini  vermeyi  reddetti.                          1986 8 Embriyo   hücrelerinin   çoğaltılmasıyla  çok  sayıda  kuzu  elde  edildi.                           1987 8 İnsan  embriyosu  klonlandı  çok  tepki  aldı.        J.Hall                                  1993

✔ Dolly  klonlandı.                                                      I.Wilmut          1997 8 Fransada  bir  dananın  63  klonu  elde  edildi.                                                                              1999

8 Totipotent  stem  hücrelerinden    deneysel  organogenezis                          2000 8 Farede    gen  klonlama  yöntemiyle    insan  kulağı  gelişimi  sağlandı.          2001 8 Avusturalyada    bir  at  klonlama  ile  Coada  eşek  doğurdu.                              2002 8 Amerikada  ex  vivo yapay  rahim  geliştirildi.                                                                            2002

Tarihçe -­‐Yerleşik

yaşama geçen insanların, dayanarak, seleksiyon yapmaları

gözlemlerine

-­‐Klasik bitki ve hayvan yetiştiriciliği ve iyileştirilmesi (tür içinde kısıtlı) -­‐Doku ve hücre kültürlerinin geliştirilmesi ⇒ Somatik hücre genetiği ⇒ Rekombinant DNA teknolojisi

Rekombinant  DNA  teknolojisi Rekombinant DNA teknolojisi’nin genetik temeli; rekombinasyon Rekombinasyon: Yeni bileşim – yeniden oluşum. Bir molekülün-­‐hücrenin, atasal “wild type” yada ilkin(orijinal) yapısından farklılık göstermesi durumudur. I -­‐ In vivo rekombinasyon II-­‐ In vitro rekombinasyon

Rekombinasyon, farklı genotipteki bireyler arasında eşleşmeler meydana geldiğinde, ana-­‐babaya ait kalıtsal özelliklerin dölde değişik gruplanmalar halinde bir araya gelmesine yol açan olaylar dizisidir.

Rekombinant  DNA  teknolojisi REKOMBİNANT DNA: Doğal olarak bir arada bulunması mümkün olmayan DNA moleküllerinin birleştirilerek yeni bir kombinasyon oluşturulmasını ifade eder. Moleküler düzeyde rekombinasyon farklı nükleotid dizilerine sahip iki DNA molekülünün homoloji gösteren bölgeleri arasındaki parça alış verişi sonucunda meydana gelen yeni gruplanmalardır. →

rekombinant DNA molekülleri→

Rekombinasyonun  Temeli • Eşeyli üreme gösteren organizmalarda (ökaryotlarda) genelde mayoz bölünmedeki crossingover olayı sonucunda, Bakterilerde; transformasyon, konjugasyon ve transdüksiyon sonucu meydana gelir. • Krossingover işlemi; rekombinant DNA oluştursa da, rekombinant DNA terimi, daha çok farklı biyolojik kaynaklardan elde edilen DNA moleküllerinin birleştirilmesi anlamında kullanılır. Bu olayların hepsinin temeli DNA molekülleri arasında homoloji (benzerlik) olmasına dayandığı için, doğada rekombinasyon olayı aynı türe ait bireyler arasında ya da çok yakın türler arasında kısıtlı kalmıştır.

Rekombinasyonun  Temeli Cohen ve arkadaşları (1973); rekombinasyon olayının, birbiriyle hiç ilişkili olmayan organizmalara ait DNA molekülleri arasında in vitro olarak ve istenilen biçimde gerçekleştirilebilmesi v Doğal rekombinasyon mekanizmalarıyla olanaksız olan yeni gen kombinasyonlarının bu teknolojiyle mümkün olması. vBir organizmanın genotipi önceden belirlenmiş ve yönlendirilmiş şekilde değiştirilebilmesi.

Rekombinant DNA  Teknolojisi Rekombinant DNA teknolojisi (genetik mühendisliği), bir organizmadan herhangi bir yolla izole edilen bir genin (DNA parçasının) uygun bir konağın içerisine sokularak orada çoğalmasını ve bazen de anlatım yapmasını amaçlayan çalışmalara ait tekniklerin toplamıdır. Bu teknoloji, en geniş anlamda, belli bir amaca yönelik olarak doğrudan genetik materyal üzerinde yapılan çalışmaları kapsar.

Klonlama  Tipleri I. DNA/Gen     düzeyinde   klonlama II. Hücre  düzeyinde   klonlama III. Organizma   /çekirdek   düzeyinde   klonlama

Başarılı  Klonlama  Yapabilmek  İçin  Gen; 8 Bağımsız  olarak  replike  olabilmeli 8 Konak  hücreye  kolaylıkla  transfer  edilebilmeli 8 Seleksiyona  olanak  tanımalı

DNA/Gen    düzeyinde  klonlama

Gen  Klonlama Gen klonlaması, bir organizmadan elde edilen ve içinde istenilen geni taşıyan DNA parçalarının, taşıyıcı özellikte bir DNA molekülüne (vektör) bağlanarak rekombinant DNA oluşturulması; rekombinant DNA moleküllerinin uygun bir konak hücreye sokularak orada çoğaltılması Konak hücreler çoğaldıkça rekombinant DNA molekülleri döllere geçerler ve yavru hücrelerde de kopya sayılarını artırırlar. Çok sayıda hücre bölünmesiyle oluşan bir klonda hücrelerin her birinde istenilen geni taşıyan rekombinant DNA moleküllerinin bir ya da daha fazla sayıda kopyası bulunur.

• Gen klonlaması “Gene cloning” (ya da DNA klonlaması) tek bir genden (DNA molekülü parçasından) kökenlenen ve hepsi birbirinin aynı olan bir DNA populasyonu elde etmektir. Rekombinant DNA teknolojisi ile sentezlenen identik DNA/gen kopyalarına denir. • Klon (Clone) : tek bir atadan kök alan, birbirine özdeş organizmalar ya da hücrelerdir. Klon Bir tek atasal diploid hücreden mitoz bölünme yoluyla birden fazla hücre eldesine denir. Genel anlamda Klonlama; Moleküler biyoloji teknikleri kullanarak bir DNA dizisine eş DNA üretmek veya bir hücreden yola çıkarak hücre bölünmesi ile genetik olarak birbirine eş hücre grubunun oluşturulmasıdır.

Gen  klonlamanın  hedefleri: 1. Genleri tanımak ve fonksiyonlarını öğrenmek 2. İnsan sağlığı veya ticari bakımdan önem arz eden proteinlerin ucuz ve kolay bir şekilde üretilmesi, saflaştırılması ve kullanıma sunulması 3. Enzim ve özellikle kanser tedavisine yönelik olarak monoklonal antikorların ucuz ve kaliteli olarak üretilmesi 4. Hormonların, antibiyotiklerin ve antioksidanların (vitaminler) üretimini sağlayarak etkilerini arttırma, yan etkilerini azaltma ve maliyetini düşürme 5. Aktif ve önemli proteinleri hücre kültüründe bol üretme

Gen  klonlamanın  hedefleri: 6. Bazı metabolitlerin ilaç olarak kullanılması için uygun sentez ve üretim yöntemi üretme 7. Hücre doku ve kültürü çalışmaları ile bitki doku ve hücrelerinden bitki üretimi 8. Suni doku ve organ üretimi 9. Gen tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi 10. Hayvanlarda ıslah metodlarının geliştirilmesi 11. Aşı üretimi 12. Ülkemizde yetişen yüksek ekonomik değeri olan organizmaların gen analizlerinin yapılması ve rekombinant meyve ve sebzelerin üretilmesi …..ve daha birçok hizmet alanı oluşabilir!

Gen Klonlamasının   Aşamaları  ve Kullanılan   Temel Yöntemler

Gen Klonlamasının  Aşamaları   A.  GEN  İZOLASYONU  (Total  mRNA  izolasyonu,  cDNA  

üretimi) B. REKOMBİNANT DNA MOLEKÜLLERİNİN OLUŞTURULMASI Rekombinant DNA eldesi C. KLONLANACAK GENİ TAŞIYAN DNA PARÇALARI İLE VEKTÖRE BAĞLANMASI (LİGASYON) D. REKOMBİNANT DNA MOLEKÜLLERİNİN KONAK HÜCRELERE SOKULMASI Rekombinant DNA’nın hücreye transferi ve çoğaltılması, cDNA kütüphanesi, Genomik DNA kütüphanesi, Kütüphanelerin problar ile taranması, Klonlanan genin doğrulanması E. REKOMBİNANTLARIN SELEKSİYONU

A.  GEN  İZOLASYONU

A.  GEN  İZOLASYONU * İlgilenilen geni taşıyan DNA parçalarının elde edilmesidir. Bu amaçla; **Bir organizmadan izole edilip saflaştırılmış DNA moleküllerini, çift zincirli yapılarını bozmadan, parçalamak amacıyla; •Mekanik yöntemler (kontrollü çalkalama, ultrason uygulaması vb.) •!!! Restriksiyon endonukleazları’nın kullanımı

Restriksiyon  Endonukleazları   (Restriksiyon  Enzimleri) Çift zincirli DNA moleküllerinde özel baz dizilerini tanıyan ve her iki zincirde kesme yapan enzimler endodeoksiribonukleazlar’dır. Bu enzimler, bakterilerde hücre içine giren yabancı DNA ’ ları (örneğin faj DNA ’ larını) parçalamakta ve onların aktivitelerini kısıtlamakta iş görürler (restriksiyon). Bakteri kendi DNA ’ sını bu enzimlerin etkisinden restriksiyon endonukleazın tanıdığı nukleotid dizilerindeki bazı bazları metilleyerek korur (modifikasyon).

Restriksiyon Enzimleri v Modifikasyon enzimi tanıdığı dizi içindeki özel yer veya

yerlere genellikle bir metil grubu ekler.

vRestriksiyon enzimi değişikliğe (modifikasyona) uğramamış bir tanıma dizisinin varlığında bir endonukleaz gibi davranır ve DNA’nın her iki zincirini bir ya da bir çok kere kesecek biçimde işlev yapar. vRestriksiyon enzimleri; DNA da çift zincirdeki, çoğunlukla 4-­‐6 baz çiftinden oluşan, özel dizileri (palindrom) tanırlar. Örneğin, 5’-­‐ G A A T T C –3’ 3’-­‐ C T T A A G – 5‘

Restriksiyon  Enzimlerinin  Sınıflandırılması Tip I restriksiyon endonukleazları, çift zincirli DNA da bir tanıma dizisi ile etkileşime girdikten sonra DNA boyunca 1000-­‐5000 nukleotidlik bir mesafede ilerleyip DNA’nın bir zincirinde gelişigüzel bir noktada kesme yaparlar. •Restriksiyon ve modifikasyon aktiviteleri aynı enzim tarafından gerçekleştirilir. 3 alt birimden (DNA da özel bir diziyi tanıyan, DNA yı metilleyen ve kesme yapan) oluşurlar. Bu alt birimlerin ancak üçü birlikte olduklarında işlevlerini yapabilir; buna göre, restriksiyon endonukleaz aktivitesi metilleyici aktivitesi olmaksızın DNA da kesme yapamaz. Hem kesme hem de metilleme reaksiyonları için ATP ve S-­‐adenozilmetionin gereklidir.

!!! II. tip restriksiyon endonukleazları, çift zincirli DNA molekülünde rotasyonal simetri eksenine sahip bir kaç (4-­‐6) nukleotidlik bir hedef diziyi tanırlar ve bu hedef dizide kesme yaparlar. Bazıları iki zincirde hedef dizideki tanıma noktalarından belli uzaklıkta ve zıt yönde (zikzak biçiminde) kesmeler yaparlar. Oluşan parçaların uçlarında birbirinin tamamlayıcısı tek zincirli çıkıntılar meydana gelir (yapışkan uçlu parçalar). Bazıları ise hedef dizideki tanıma noktalarında tam karşılıklı olarak iki zincirde kesme yaparlar (küt uçlu parçalar). II. tip enzimlerin restriksiyon ve modifikasyon aktiviteleri ayrıdır ve birbirinden bağımsız olarak çalışabilir. Kesme aktivitesi için ATP ve S-­‐adenozilmetionine gereksinimleri yoktur.

Restriksiyon  Enzimlerinin  Adlandırılma   Sistemi  (Smith  ve  Nathans,  1973) a) Konak organizmanın cins adının ilk harfi ve tür adının ilk iki harfinden meydana gelen, italik biçimde yazılan, üç harfli bir kısaltma; örneğin, E. coli’’ye aitse Eco, H. influenza’ya aitse Hin. b) Konak bakterinin ırk veya tipine ait simgenin alt yazı ile verilmesi; örneğin, EcoK gibi. Restriksiyon-­‐modifikasyon sistemi bir virus veya plazmidde bulunuyorsa bu özelliğin de alt yazı ile belirtilmesi; örneğin, EcoR1. c) Konak organizma birden fazla restriksiyon-­‐modifikasyon sistemine sahipse bunların Romen rakamlarıyla belirtilmesi; örneğin., HindI. d) Restriksiyon enzimlerinin (R), modifikasyon enzimlerinin (M) olarak belirtilmesi; örneğin, R.HindIII, M.HindIII. (Pratikte, bütün kısaltmalar aynı hizada yazılmakta ve sadece restriksiyon enzimleri söz konusu olduğunda R simgesi de kullanılmamaktadır)

•AarI

•BseNI (BsrI)  

•Eam1105I

•HpyF10VI (MwoI)    

•AasI (DrdI)    

•BseSI

•Ecl136II (SacI)  

•KpnI

•PfoI Psp5II (PpuMI)  

•AatII

•BseXI (BbvI)  

•Eco24I (HgiJII)  

•Kpn2I (BspMII)  

•Psp1406I (AclI)  

•Acc65I (KpnI)  

•Bsh1236I (FnuDII)  

•Eco31I

•KspAI (HpaI)  

•PstI

•AdeI (DraIII)  

•Bsh1285I (McrI)  

•Eco32I (EcoRV)  

•LweI (SfaNI)    

•PsuI (XhoII)  

•AloI

•BshNI (HgiCI)  

•Eco47I (AvaII)  

•MbiI (BsrBI)  

•PsyI (Tth111I)  

•AluI

•BshTI (AgeI)  

•Eco47III

•MboI

•PvuI

•Alw21I (HgiAI)  

•Bsp68I (NruI)  

•Eco52I (XmaIII)  

•MboII

•PvuII

•Alw26I (BsmAI)  

•Bsp119I (AsuII)  

•Eco57I

•MlsI (BalI)  

•RsaI

•Alw44I (ApaLI)  

•Bsp120I (ApaI)  

•Eco57MI

•MluI

•SacI

•ApaI

•Bsp143I (MboI)  

•Eco72I (PmaCI)  

•MnlI

•SalI

•BamHI

•Bsp143II (HaeII)  

•Eco81I (SauI)  

•Mph1103I (AvaIII)  

•SatI (Fnu4HI)  

•BclI

•Bsp1407I

•Eco88I (AvaI)  

•MspI (HpaII)  

•ScaI

•BcnI (CauII)  

•BspLI (NlaIV)  

•Eco91I (BstEII)  

•MssI (PmeI)  

•SchI (PleI)  

•BcuI (SpeI)  

•BspPI (BinI)  

•Eco105I (SnaBI)  

•MunI (MfeI)  

•SdaI (Sse8387I)  

•BfiI

•BspTI (AflII)  

•Eco130I (StyI)  

•MvaI (EcoRII)  

•SduI

•BfmI (SfeI)  

•Bst1107I (SnaI)  

•Eco147I (StuI)  

•Mva1269I (BsmI)  

•SmaI

•BfuI

•BstXI

•EcoO109I (DraII)  

•NcoI

•SmiI (SwaI)  

•BglI

•Bsu15I (ClaI)  

•EcoRI

•NdeI

•SmuI (FauI)  

•BglII

•BsuRI (HaeIII)  

•EheI (NarI)  

•NheI

•SspI

•Bme1390I (ScrFI)  

•BveI (BspMI)    

•Esp3I

•NmuCI (Tsp45I)  

•TaaI (Tsp4CI)  

•BoxI (PshAI)  

•CaiI (AlwNI)  

•FspAI

•NotI

•TaiI (MaeII)  

•BpiI (BbvII)  

•CfrI

•GsuI

•NsbI (MstI)  

•TaqI

•BplI

•Cfr9I (SmaI)  

•Hin1I (AcyI)  

•OliI

•TasI (TspEI)  

•Bpu10I

•Cfr10I

•Hin4I  

•PaeI (SphI)  

•TatI

•Bpu1102I (EspI)  

•Cfr13I (AsuI)  

•Hin6I (HhaI)  

•PagI (BspHI)  

•TauI

•BseDI (SecI)  

•Cfr42I (SacII)  

•HincII (HindII)  

•PauI (BsePI)  

•Tru1I (MseI)  

•BseGI (FokI)  

•CpoI (RsrII)  

•HindIII

•PdiI (NaeI)  

•Van91I (PflMI)  

•BseJI (BsaBI)    

•Csp6I (RsaI)  

•HinfI

•PdmI (XmnI)  

•VspI

•BseLI (BsiYI)  

•DpnI

•HpaII

•Pfl23II (SplI)  

•BseMI (BsrDI)  

•DraI (AhaIII)  

•HphI

•BseMII

•Eam1104I (Ksp632I)  

•Hpy8I (MjaIV)  

•XagI (EcoNI)   •XapI (ApoI)   •XbaI •XceI (NspI)   •XhoI •XmaJI (AvrII) •XmiI (AccI)

DNA  kopyasının  (c  DNA)  elde  edilmesi vHücrelerden, klonlanması amaçlanan genin transkripsiyon ürününü de içeren, RNA moleküllerinin izolasyonu. v Ters (revers) transkriptaz enzimiyle bu RNA moleküllerinin tamamlayıcısı olan DNA kopyalarının çıkarılması (cDNA).

PCR  yöntemi ³ DNA moleküllerindeki özel dizilerin (örneğin istenilen bir genin) hücre içerisine sokulmadan izole edilip çoğaltılabilmesi. ³ Genomdan istenilen (çok az miktarda olabilen) bir bölgenin, milyonlarca kopyasının elde edilebilmesi. !!! Bu dizinin (aynı organizmadaki ya da yakın bir başka organizmadaki) hiç değilse bir kısmının daha önceden bilinmesi gerekli. v Nukleotid dizisi bilinen bir bölgeden yararlanılarak (çoğaltılacak olan bölgenin bulunduğu DNA’da farklı zincirlerdeki zıt uçların tamamlayıcısı özellikte) 2 oligonukleotid (primer) sentez edilmesi.

PCR  yöntemi v Her reaksiyonu üç temel aşamadan oluşan PCR’nin uygulanması: (1) DNA nın denatürasyonu, (2) Primer dizilerin DNA nın tek zincirlerine bağlanması, (3) DNA polimeraz tarafından zincir uzatma reaksiyonu. Denatürasyon için, kısa süreli yüksek sıcaklık uygulaması, ortamdaki primerlerin birbirinden ayrılmış zincirlere bağlanarak replikasyonun başlatması için sıcaklık derecesinin düşürülmesi. Enzim, yüksek sıcaklığa dayanıklı bir DNA polimeraz (örn. termofilik bakteri, Thermophylus’dan elde edilen Taq polimeraz ).

Her reaksiyon çevriminde kalıp zincir sayısı logaritmik olarak artması nedeniyle kısa bir zaman süresi (bir kaç saat) içinde çok sayıda ve istenilen geni taşıyan DNA parçası oluşması; örneğin, 35 çevrim sonunda hedef DNA ’ nın (genin) kopya sayısında ~ 1 milyon kat artış.

B.  REKOMBİNANT  DNA   MOLEKÜLLERİNİN  OLUŞTURULMASI

B.  REKOMBİNANT  DNA  MOLEKÜLLERİNİN   OLUŞTURULMASI •

İzole edilen geni taşıyan DNA parçalarının taşıyıcılık görevi yapacak uygun DNA moleküllerine bağlanmasıyla elde edilen moleküllerin (rekombinant DNA) elde edilmesi.

• Genetik mühendisliğinde rekombinant DNA, doğal olarak birlikte bulunmayan (farklı kökenli) DNA molekülleri (veya parçaları) arasında laboratuvar koşullarında yaratılmış yeni düzenleme (birlik).

Taşıyıcı  (vektör)  DNA  molekülleri   Konak hücre içine kolaylıkla girebilmeleri ve buna göre taşıdıkları geni istenilen bir konak içine sokabilmeleri. v

v Bağımsız replikasyon yapma yetenekleri ve böylece çoğalmaları sırasında ona bağlı olan ve kendi başına çoğalma yeteneği genellikle olmayan genin (DNA parçasının) de çoğalması, kaybolmadan döle geçmesi ve çok sayıda kopyasının meydana gelmesi (gen amplifikasyonu). Rekombinant DNA= bir yolcu (geni içeren DNA parçası) + onu taşıyan bir taşıt aracı (vektör DNA’sı)

Kullanılan  vektör  sistemler • • • • • • •

Plazmid  vektörler   Viral  vektörler   kosmidler Ekspirasyon  (shuttle)  vektörler   Ti  plazmidi   Cosmid  vektörler   Yac  Vector  

Genetik  Klonlamada  Kullanılan   Vektörler 8 Plazmid                                                   5-­‐10    kb 8 Bakteriyofaj                                             20    kb 8 Cosmid                                                             50  kb 8 YAC                                                                100  kb 8 Baculovirus                                       150  kb 8 BAC                                                                 200  kb 8 PAC                                                               250-­‐300  kb

1.  PLAZMİDLER Bakteri hücrelerinde ve bazı ökaryotik hücrelerde (örneğin, mayalarda) esas DNA molekülünün dışında, daha küçük, (genellikle) halka biçiminde çift zincirli DNA molekülleri. v Bağımsız replikasyon yapma yeteneği v (Bazılarında) bir hücreden diğerine geçebilme yeteneği v (Bazılarında) esas DNA molekülünün yapısına da girebilme yeteneği v Replikasyon ve transfer ile ilgili genler dışında (çoğu kez) diğer bazı işlevlere ilişkin genleri taşıma

Başarılı  plazmid  vektör  geliştirilmesinde  önemli   ölçütler 1. Plazmid vektör mümkün olduğu kadar küçük olmalı ve ilgilenilenlerin dışında genetik bilgi hiç taşımamalı ya da çok az taşımalıdır. Plazmidin küçük molekül ağırlıklı olmasının avantajları v İzolasyon ve çalışma kolaylığı, v Hücredeki kopya sayılarının çok olması → klonlanan genin dozaj etkisinin artması vRestriksiyon enzimlerine ait çok sayıda hedef noktası bulunması olasılığının az olması 2. İstenilen konak içinde kolaylıkla çoğalabilmeli ve sonuçta fazla sayıda vektör ve dolayısıyla rekombinant molekül elde edilebilmeli.

Başarılı  plazmid  vektör  geliştirilmesinde  önemli   ölçütler 3. Konakta kararlı devamlılık göstermeli. 4. Konakçı sınırı geniş olmalı. 5. Genlerin yerleşim bölgeleri, restriksiyon enzimlerinin kesme yerleri ve (mümkünse) nukleotid dizisi iyi bilinmeli. 6. Transformasyona uğrayan hücrelerin uğramayanlardan ayırt edilmesine olanak verecek ve kolaylıkla seçilebilir (örneğin, antibiyotiklere direnç sağlama gibi) fenotipler veren bir ya da bir kaç işaret (“marker”) gene sahip olmalı. 7. İdeal olarak, yabancı bir DNA parçasının girişiyle veya restriksiyon enziminin kesmesiyle aktivitesini kaybedecek ek işaret genleri de taşımalı (girişe bağlı inaktivasyon). 8. İşaret genin birinde ya da diğerinde bulunan çok sayıda değişik restriksiyon endonukleazlara ait kesme noktalarını içermeli.

Plazmidler • gen aktarımında başarılı • geniş çapta kullanılmakta Özellikle fazla büyük olmayan DNA parçalarının klonlanmasında başarı şansı daha yüksek .

2.  VİRUS  DNA’LARI Çift Zincirli DNA Virusleri En başarılı sonuç verenleri bakteriyofajlar (özellikle ılımlı fajlar) Ilımlı fajlarda ° litik yaşam

° lizojenik yaşam

λ fajı Genomu ~49 kb çiftlik doğrusal ve çift zincirli DNA molekülü. Konak hücrede DNA ’ nın iki ucundaki tamamlayıcı tek zincirli bölgelerin eşleşmesiyle ⇒ halka biçimi [cos bölgesi (yapışkan yer, “cohesive site”)] ⇒ vektör geliştirilmesinde önemli. λ fajının tüm genleri tanımlanmış ve haritalanmıştır; tüm dizisi bilinmektedir. Genomdaki genlerin yerleşim biçimleri ⇒ kümeler oluşturmaları ⇒ klonlama vektörü olarak kullanılmalarında avantaj.

Orta kısımda bakteri genomuna girişi kontrol eden (lizojenik yaşam için gerekli olan) Genomun sağında ve solunda litik evre (lizis ve kapsid oluşumu) için gerekli olan genler

λ fajı λ fajı partikülünün olgunlaşması sırasında, fajın baş kısmı genom DNA’sının % 75-­‐105’ini kılıf içine alabilir. λ vektör sisteminin temel özelliği başın DNA ile tam olarak dolması gerekliliğidir. Lizojenik evre genleri genomun sadece % 23.3 ünü kapsadıkları için, bu parçaları yok edilmiş fajlarda başın tam dolması kuralı etkilenmez ve faj litik üreme yapabilir. Bu nedenle, bu bölgenin yerine yabancı DNA sokulduğunda fajın bakteriye bulaşma yeteneği etkilenmez ve plak oluşturur. Ayrıca, bu bölgenin yerine sokularak λ vektörüyle boyu 14 kb (% 28) kadar olabilen yabancı DNA parçaları taşınabilir.

λ fajı Normal tipte λ DNA’sı restriksiyon endonukleazları için çok sayıda hedef noktası içerdiği için uygun bir vektör değildir. Geliştirilmiş λ vektörler: v Delesyonlar yapılarak, yabancı DNA nın girebileceği tek hedef noktasına sahip girme tipi vektörler v Yabancı DNA tarafından yok edilerek yeri alınacak bir parçada (özellikle lizojenik yaaşamı etkileyen bölgede) restriksiyon enzimleri için bir çift veya daha fazla hedef noktaya sahip yer değiştirme tipi vektörler

λ fajının vektör olarak kullanım avantajları

v 40 kb kadar büyük DNA’ları içine alıp bakterilere sokabilmeleri v Bakteriye plazmidlere göre çok daha yüksek oranda girebilmeleri

Biyolojik içerikte güvenlilik Konak ve vektörün sadece laboratuvardaki özel üreme koşullarında canlılıklarının ve devamlılıklarının sağlanması → litik üreme için gerekli genlere anlamsız mutasyonlar sokulması (güvenilir λ vektörler). Bu mutasyonlar faj üretimini tamamen engeller. Ancak, bu mutasyonları baskılama yeteneğinde olan bazı E. coli K-­‐12 ırklarının konak olarak kullanılmasıyla faj üretimi sağlanabilir.

Tek  Zincirli  DNA  Virüsleri. M13  fajı Genomu 6407 nukleotidden oluşan tek zincirli halka biçiminde. DNA’sı bakteriye girdiğinde ⇒ RF molekül (Replikatif form) ~100-­‐200 yeni RF molekül sentezi sırasında, (-­‐) zincir virus genlerinin ürünlerinin sentezini de sağlar. Bu ürünlerden biri, artık sadece (+) zincirlerin sentez edilmesini yol açar. (+) zincirler kılıf proteinleri içinde paketlenerek olgun faj partiküllerini oluştururlar. Faj partikülleri hücre çeperi parçalanmadan (veya hücre zarar görmeden) hücreden çıkarlar. Ancak, infeksiyon hücrelerin üremesini yavaşlatır ve M13 fajı yeni bakterilerde infeksiyona devam ettikçe hücrelerde üremenin yavaşlamasını gösteren plaklar meydana gelir.

M13  fajı M13 fajının RF DNA ’ sının klonlama vektörü olarak kullanımı Oldukça küçük olan bu M13 DNA ’ sı restriksiyon enzimlerine ait tek hedef noktaları içerir. Yabancı DNA, M13 içine girdiğinde bu diziyi taşıyan tek bir zincir faj içerisinde paketlenir ⇒ İki zincire ait bilginin M13 aracılığıyla ayrı ayrı klonlanma olasılığı !!! M13 vektörüyle klonlama ⇒ Sanger tekniğiyle nukleotid dizisi saptanması

⇒ in vitro mutagenez

M13 DNA’sından geliştirilmiş vektörlere bir örnek: E. coli β-­‐galaktosidaz geninin bir kısmı + promotör ve operatör bölgeyi içeren 200 nukleotidlik kısım (klonlama bölgesi) Yabancı genin başarılı şekilde sokulması için, klonlama bölgesinde ~ 50 nukleotidlik yapay bir DNA parçası (EcoRI, BamHI, SalI, PstI vb için tanıma dizileri) (çoklu klonlama yeri) Vektörün lac bölgesine yabancı DNA’nın girmesi β-­‐galaktosidaz sentezini yok eder ⇒ (X-­‐gal içeren) seçici besi ortamında faj plakları renksiz olur, rekombinant olmayan mavi renklilerden kolaylıkla ayırt edilebilir.

SV40

Memeli  Hücrelerindeki  Klonlamalarda   Kullanılan  Virüs  Vektörler

Genomu oldukça küçük (5243 bç) halka biçimindeki çift zincirli DNA molekülü. Genomun restriksiyon haritası, nukleotid dizisi tanımlanmış ve genlerinin yerleri bilinmektedir. Genomu hem bağımsız hem de konak hücre kromozomlarının bir parçası gibi çoğalabilir. Konak hücredeki litik infeksiyon aşamaları: •protein kılıfın yok olarak virus DNA ’ sının nukleusa hareketi, erken mRNA ve protein sentezi ve virusun teşvik ettiği konak hücrenin DNA sentezi, geç mRNA ve protein sentezi, hücresel parçalanma (lizis).

SV40 SV40’ın normal tipi vektör olarak kullanılamaz (⇐ yabancı DNA eklendiğinde virus partikülü içine sığamayacak kadar büyük bir DNA molekülü meydana gelir). ⇒ Uygun restriksiyon enzimleri ile (örneğin geç anlatım yapan genlerin bulunduğu bölge) kesilerek kullanıma uygun hale getirilebilir. ⇒ Virüsün genomunda transkripsiyonun başlaması, tamamlanması, işlenme ve poli A kuyruğu eklenmesiyle ilgili olan ve vektör olarak kullanımda gerekli olan genlerin kalması sağlanır.

SV40’ın  vektör  sistemi  olarak  kullanımı SV40 DNA’sı ile yabancı DNA’nın bir parçası arasında rekombinantlar meydana getirmek ve melez molekülleri izin veren (permisiv) hücreler içine sokmak ⇒ rekombinant DNA içeren kapsülle çevrili virionlar oluşturmak. v SV40 ile yabancı DNA arasında rekombinantlar oluşturmak ve virionlar halinde paketlememek. ⇒ Rekombinant DNA ya hücre DNA’sından bağımsız olarak plazmid gibi replikasyon yapar ya da bir kromozomun içerisine yerleşir.

SV40’ın  vektör  sistemi  olarak  kullanımı Rekombinant DNA içeren SV40 partikülleri meydana getirmek için, SV40 DNA’sının erken veya geç bölgesinin yerine yabancı DNA’nın bir parçasının geçirilmesi ⇒ Rekombinant moleküller virusun temel işlevlerini yapacak ürünleri sentez edemezler; çünkü, örneğin, erken bölgede T antijenleri geç bölgede de kapsid proteinlerini şifreleyen genler bulunur. Bu nedenle, yabancı DNA içeren virus partikülleri elde etmek için eksik virus fonksiyonları, aynı anda yardımcı ( “ helper ” ) virus partikülleri kullanılarak komplemantasyonla sağlanır.

SV40  dışında  vektör  olarak  kullanılan  başka   hayvansal  virüs  çeşitleri Hayvansal viral vektörlerin geliştirilmesi v Memeli hücreleri konak olarak kullanılarak DNA dizilerinin replikasyonla doğrudan klonlanması v Yabancı genlerin genomda (örneğin bir genetik hastalığa yol açan) bir allelin yerini almak üzere transfer edilmesi.

• Konakta kromozom dışında bağımsız olarak çoğalan vektörler. Çoğu “bovine papilloma virus” dan türevlenir. Virüs genomunun bir kısmını ve yabancı DNA ’ nın gireceği restriksiyon noktalarını içerirler. • Konağın genomuna giren vektörler. Kuş ve fareleri konak olarak kullanan retroviruslardan geliştirilirler. Retrovirusların bazı genleri yok edilir ve yabancı genleri taşıyacak biçime getirilir.

Bitki  Hücrelerindeki  Klonlamalarda  Virus   Vektörler Çift zincirli Caulimoviruslar ve tek zincirli Geminiviruslar Caulimoviruslar’ın pek azının biyolojik özellikleri bilinmektedir. Konak sayısı kısıtlı ve konakta (özellikle, tahıl bitkilerinde) önemli hastalıklar meydana getirirler. En iyi bilinen örnek, karnıbaharda mozayik hastalığına yol açan “cauliflower mosaic virus” (CaMv). CaMV genomu 4.5-­‐5 megadaltonluk çift zincirli halka biçiminde DNA molekülü. Vektör olarak kullanımıyla ilgili çalışmalar başlangıç aşamasında ve bazı olumsuz özelliklere sahip. Örneğin, virusun saf DNA’sı bulaşıcı olduğu halde özel bir bölgeden kesildiğinde bu özelliğini kaybetmektedir. Restriksiyon enzimleri tarafından çok sayıda noktada kesilmektedir. Konak hücrenin kromozomları içine girebildiğine ilişkin kanıt henüz yoktur. Ayrıca, DNA’sının replikasyonu ve genlerinin işlevleri de pek bilinmemektedir..

Kosmidler  (“Cosmid”ler) • Cosmid vektörler hem λ virus vektörü gibi cos bölgesi içeren , hem de plazmid vektörler gibi ori ve antibiyotiğe dirençlilik genlerini içeren DNA molekülleridir. Bu sayede, l vektöründe olduğu gibi rekombinant molekül virus parçalarına sokulabilir ve plazmid vektörde olduğu gibi bakteride çoğaltılıp seçilebilir. Cosmid vektörler, yaklaşık 45 kb büyüklüğünde DNA yı taşıyabilirler.

Cosmid  Vektörlerinin  Oluşum  Aşamaları • λ cos bölgesini içeren plazmid BamHI gibi bir restriksiyon endonükleaz la kesilir ve böylece linear hale getirilir. • Linear yapı 5 ’ fosfatların uzaklaştırılması için alkali ile muamele edilir. Böylece yapının tekrar halkasal hale gelişi engellenir. • 35-­‐45 kb büyüklüğündeki ökaryotik DNA fragmentleri linear hale getirilmiş plazmidle muamele edilir. • Bu hale getirilmiş cosmid vektör virusun kapsidi içine konur. Virusun bakteriyi enfekte etmesi sağlanır. • Virus içindeki bu yapıyı bakteriye verir. Bakteri içine giren bu rekombinant DNA cos genleri ile halkasal hale gelir. • Daha sonra bu vektör, üzerinde bulunan orjin noktası ve antibiyotiğe direnç geni sebebiyle antibiyotik bulunan kültürlerde bakteri tarafından çoğaltılır.

Kosmidler (“Cosmid”ler) λ DNA’sının “cos” bölgesi + plazmidlerde antibiyotiklere direnç ve replikasyon için gerekli genlerin taşındığı kısımlar. Kosmidler ( “ cosmidler ” ), bakteri hücresine faj gibi bulaşır ve hücre içinde plazmid gibi çoğalırlar. λ vektörünün maksimum klonlama yeteneği ile plazmid vektörlerin en iyi yeteneklerini bir arada taşırlar. ⇒ (λ genomunun hemen tamamı kaybolduğu için) taşıma kapasitesi ~ 45-­‐50 kb’a kadar yükselebilir. ⇒ ökaryotik kullanılırlar.

genlerin

klonlanmasında

başarıyla

Mekik  Tipi  (“Shuttle”)  Vektörler • Bu vektörün en büyük özelliği iki alıcı hücresinin bulunmasıdır. Vektör bu alıcı hücrelerin birisinde sayısal olarak çoğalırken, diğerinde klonladığımız geni ürüne dönüştürür. • Üzerinde her iki alıcı hücrede de çoğalmasını sağlayacak orjin noktaları ve her iki konumda da ayırdedilebileceği marker genleri taşır. • Bu vektör üzerinde bakteriye ait orjin ve ampisiline direnç geni vardır. Eğer bu yapı transformasyonla ampisiline hassas bakteriye verilir ve besiyeri ortamına da ampisilin konursa bakteri bu yapıyı çoğaltacaktır. Böylece klonlanan genin yapısı incelenebilir.

Mekik  Tipi  (“Shuttle”)  Vektörler • Bu yapıyı Leu` olan mayalara transforme eder ve besiyeri ortamına leusin koymazsak, maya leusin ihtiyacını vektördeki Leu (+) genini ürüne dönüştürerek gidecektir. Leusin oluşurken klonladığımız DNA bölgeside ürüne dönüşmüş olacaktır. Bu yapı sayesinde de genin fonksyonu çalışılabilir. • Bu sistem tıbbi ve biyolojik olarak önemli proteinlerin doğal kaynaklardan bol miktarda elde edilmesini sağlar.

Mekik  Tipi  (“Shuttle”)  Vektörler Kosmidlerin dışında, farklı kökenlerden türevlenen replikasyonla ilgili bölgelerin bir araya getirilmesiyle oluşturulmuş melez taşıyıcılar. Örneğin, bir plazmid ve SV40’ın replikasyon bölgesini taşıyanlar hem bakteri hem de hayvan hücrelerinde çoğalabilirler. Aynı şekilde, maya ve bakteriye ait plazmidlerdeki replikasyon dizilerini taşıyanlar da bu iki organizma grubunda çoğalabilirler. Bu tip vektörler, farklı konaklarda yapılabilecek işaret genleri de taşırlar.

seleksiyonu

Agrobacterium  tumefaciens’in  Ti Plazmidi. • Bitkilerdeki genetik mühendisliği çalışmaları için en önemli araç toprak bakterisi olan Agrobacterium tumefaciens ‘ in Ti plazmididir. • Agrobacterium ile enfekte bitkilerde tümör oluştuğu görülür. Bakterinin bitkide tümör hücresi oluşturabilmesi için bitkiye bir yapı aktarması gerekmektedir. Bakterinin bitkiye aktardığı yapı Ti plazmidi üzerinde bulunan T DNA bölgesidir. Bu gen bölgesi bitki kromozomuna entegre olur ve burada ifade olmaya başlar. Öyleyse bir bitkiye gen aktarılmak istendiğinde vektör olarak bu yapı kullanılabilir.

Agrobacterium  tumefaciens’in  Ti Plazmidi. • Öncelikle bakteriden plazmidi izole edilir. Plazmidin kesim noktası T DNA içindedir. Restriksiyon endonükleazla plazmid kesilir. Aynı restriksiyon endonükleazla kesilmiş klonlanacak gen plazmidle aynı ortama konur ve ortama DNA ligaz ilave edilir. Oluşan rekombinant Ti plazmidleri kültürdeki bitki hücrelerine verildiğinde üzerine klonlanacak geni taşıyan T DNA bitki hücre kromozumuna entegre olur. Bitki hücresinin bölünerek yeni bir bitki hücresi oluşturmasına izin verilir. Oluşan bitkinin her hücresi aynı zamanda klonlanan gen bölgesini içerir. • Bu yöntemle zararlılara karşı dirençli bitki varyeteleri oluşturulabileceği gibi büyüme hormonu ve grip aşısı içeren bitkiler de üretilebilir.

Yabancı genler T-­‐DNA kısmının içine yerleştirilir. Bakteri bulaşmasıyla Ti plazmidi bitki hücrelerine sokulduğunda T-­‐DNA konak hücrenin kromozomu içine girer. Bu hücrelerin kültürünün yapılmasıyla transgenik (hücreleri içinde yabancı gen taşıyan) bitkiler oluşur.

Yapay  Maya  Kromozomu   (“Yeast  Artificial  Chromosome”, YAC) Maya (Saccharomyces cerevisiae) kromozomlarının yapısındaki önemli bazı bölgeleri taşıyacak biçimde geliştirilmiş bir vektör tipi. YAC doğrusal biçimdedir, iki ucunda maya kromozomlarının telomer dizilerini, maya kromozomuna ait replikasyon başlangıç bölgesini içerir. Ayrıca, hücre bölünmesinde düzenli dağılımı sağlayacak bir maya sentromeri, seleksiyonda kullanılmak üzere işaret gen ve yabancı DNA’nın girmesine yarayacak restriksiyon noktaları bulunur. Diğer vektörlerden ayrılan en büyük özelliği çok büyük miktarlarda (100.000-­‐1.000.000 arası) DNA fragmentlerinin klonlanabilemesidir. Bu vektör en yaygın olarak insan kromozomlarının fiziksel haritasının çıkarılmasında , insan genom projesinde kullanılmaktadır.

YAC • Vektörün yapısına bakacak olursak: • CEN: sentromer dizilerini içerirler. Hücre bölünmesi sırasında vektörün kardeş hücrelere ayrılmasını sağlar. • ORİ: replikasyon orjini • ARS: otonom olarak çoğalmayı sağlayan gen dizileridir. • TEL: telomer bölgeleridir. Linear hale getirilmiş yapının stabilitesini sağlar ve nükleazlar tarafından kesilmesini engeller. • MARKERLAR: 3 marker vardır; • SUP4: bu marker SmaI in kesme noktasını içerir. Böylece yapının kesilip linear hale getirilip getirilemediği kontrol edilir . yapı linear hale gelmiş ise bu gen iş göremez hale gelmiştir. • URA 3 ve TRP I : eğer yapı kesilmiş ise iki kola ayrılmış demektir. Bu markerlar yapının sağ ve sol kolunu belirler. URA 3 sağ kolda TRP I ise sol kolda bulunur. • Ayrıca yapı BamHI ile kesilerek uçlarda telomer kısımları kalacak hale getirilir. Bu aşamadan sonra sağ ve sol kol haline gelmiş vektöre klonlanacak DNA bölgesi DNA ligazla birlikte ilave edilerek rekombinant yapı oluşturulur ve maya hücresine verilir.

YAC  VEKTÖRLERİNİN  KULLANIM  ALANLARI • Mutant genlerin incelenmesinde • Mutant farelere bir seri fare genom fragmenti verildiği takdirde mutant genlerde bir düzelme beklenir. Örn: Tirozinaz’ın normal kopyasını taşıyan YAC vektörü albino fareye verildiğinde pigment oluşumuna neden olduğu görülmüştür. Bu genlerin tanımlanabilmesi için bir yoldur. • Genetik hastalıkların izlenmesinde • Insan genetik hastalıklarının farelerdeki modellerinin gözlenmesinde kullanılır. Örn : Down sendromlu ( trizomi ) fareler üretilerek hastalığın seyri gözlenebilir. • Insan hastalıklarının araştırılması ve tedavisinde

YAC  VEKTÖRLERİNİN  KULLANIM  ALANLARI • Transgenik fareler üretilerek insan hastalıklarının incelenmesinde ve bu hastalıkların tedavisinde kullanılırlar. Örn : araştırmacılar insan immunoglobulin genleri taşıyan transgenik fareler geliştirmişlerdir. Bu fareler hastallıkların tedavisinde potansiyel bir annntikor kaynağı durumundadırlar. • YAC vektörleri kullanılarak transgenik farelerin eldesi: • YAC vektörleri fare zigotunun pronükleusuna mikroinjeksiyonla verilir. Zigot uterusa yerleştirilir ve normal gelişimi gözlenir. Diğer bir yöntem fare embriyonik kök hücresinin alıcı hücre olarak kullanılmasıdır. DNA-­‐lipid kompleksi endositozla kök hücre tarafından alınır. YAC ile kök hücre genomunun kaynaşması sağlanır. Bu hücre blastosist aşamasındaki fare embriyosuna ilave edilir.

Yapay  Bakteri  Kromozomları  (“bacterial   artificial  chromosomes”,BAC’lar) Temeli F plazmidine dayanan vektörler. F plazmidi oldukça büyük ⇒ taşıma kapasitesi fazla (→300 kb).

P1’den  Türevlenen  Yapay  Kromozomlar   (“P1-­‐derived  artificial  chromosomes”,   PAC’lar) P1 fajı DNA’sından (110 kb) türevlenen kozmid tipi vektörler. Taşıma kapasiteleri fazla (→300 kb).

C.  KLONLANACAK  GENİ  TAŞIYAN  DNA  PARÇALARI   İLE  VEKTÖRÜN  BAĞLANMASI   (LİGASYON)

⇒ Rekombinant DNA molekülleri

♦ Restriksiyon enzimleri tarafından meydana getirilen yapışkan uçların birbirini tanıması

♦ Bağlayıcı  (adaptör)  moleküller  kullanmak

♦ Homopolimerik tek zincirli kullanmak (kuyruklama yöntemi)

kuyruklar

Bağlanma  reaksiyonlarındaki  bazı  sorunlar Vektörün, kendi uçlarının birleşmesiyle, yeniden halka biçimini kazanması ⇒ rekombinant DNA oluşum olasılığının azalması. Engellemek için v Vektörün 5 ’ uçlarındaki fosfat gruplarının yok edilmesi. v Vektör ve yabancı DNA kesimlerinin yapılmasında farklı ancak uygun uçlar yaratan restriksiyon enzimleri kullanılması ya da iki DNA ’ da farklı enzimlerle çift kesmeler yapılması.

D.  REKOMBİNANT  DNA   MOLEKÜLLERİNİN  KONAK  HÜCRELERE   SOKULMASI  

Rekombinant  DNA  Moleküllerinin  Konak   Hücrelere  Sokulması   Konak olarak ilk ve en yaygın kullanılan hücreler bakteriler (özellikle Escherichia coli’). E. coli ’ nin çeşitli ırkları genetik açıdan çok iyi tanımlanmıştır; plazmid, faj ve kosmidler için konak görevi yapabilirler. Günümüzde konak olarak, mayalar, bitki ve hayvan hücreleri de geniş çapta kullanılmaktadır.

Rekombinant  DNA’nın  konak  hücreye   sokulmasında  kullanılan  yöntemler: Transformasyon, taşıyıcı: plazmid DNA’sı, konak hücre: bakteriler ve bazı ön uygulamaların yardımıyla ökaryotik (maya, bitki, hayvan) hücreleri. Transfeksiyon (transdüksiyon), taşıyıcı: virus DNA ’ sı, konak hücre: bakteriler ve ökaryotik hücreler. Ayrıca, lipozomlar vb başka taşıcılar ve mikroinjeksiyon, biyolistik, elektroporasyon vb teknikler

Memeli  Hücrelerine  Gen    Transfer   Teknikleri 8 Microinjection*** 8 DAAE-­‐Dextran  Mediated 8 Electroporation 8 Lipofection 8 Calcium  Phosphate*** 8 Protoplast  Fusion 8 Polyprene 8 Viral  infection***   (Lentivirus,  Retrovirus,  Adenovirus) *:  Yaygın  kullanılan  yöntemler

The  construction  of  Mammalian  Transfection  Vector  For   Expression  of  Cytosine-­‐ 5  Specific  DNA  Methyltransferase Gene  M.Msp1 In  Cultured  Cells Ozturk OZDEMIR Received    01.05.1997

E.  REKOMBİNANTLARIN  SELEKSİYONU  

Rekombinant DNA molekülleri

replikasyon

konak hücreler

çok sayıda kopya (klon)

Rekombinant klonların oluşumunu etkileyen aşama ve etkenler

Seleksiyon  Yöntemleri 1. GENETİK YÖNTEMLER. Konak hücreye girmiş rekombinant DNA molekülünde bulunan gen ya da genlerin belirledikleri karakterlerin gözlenmesi (fenotipik yöntemler) (dolaylı yöntemler) Çok kullanışlı (geniş bir populasyona kolaylıkla uygulanabilir)

Yöntemin kullanılabilirliğinin ön koşulu, izlenen genin içine girmiş olduğu konakta anlatım yapabilmesi (genetik komplemantasyona dayalı seleksiyon) a) Konak Hücrelerde Vektörün Seleksiyonu Vektördeki işaret genlerden yararlanılarak vektörün varlığının saptanması. b) Vektöre Sokulmuş DNA Parçasındaki Genin Seleksiyonu Yabancı (özellikle klonlanan) DNA parçasını taşıyan vektörlerin (rekombinant DNA moleküllerinin) seleksiyonu.

Klonlanan DNA parçasının vektördeki bir işaret genin içine girmesi sonucunda o genin anlatımının (ve gene özel karakterin) ortadan kalkmasının izlenmesi. ♦

Transformasyon

Beyaz  renkli  koloniler  hedef  geni   taşımaktadır

♦ Klonlanması amaçlanan genin konak hücrede anlatım yapabildiği koşullarda, genetik komplemantasyondan yararlanılarak doğrudan söz konusu genin seleksiyonunun yapılması. Örneğin, bazı biyosentez genlerini taşıyan E. coli DNA parçaları oksotrofik özellikteki konak E. coli ’ de komplemantasyon yapmalarıyla seçilebilir.

Seleksiyon  Yöntemleri 2. İMMÜNOKİMYASAL YÖNTEMLER Sokulduğu konak hücrede anlatım yapabilen bir yabancı genin varlığının immünokimyasal olarak saptanması. Yöntemin avantajı, konakta seçilebilecek bir fenotipik özelliğe yol açmayan genlerin de saptanmasına olanak vermesi. Yöntemin uygulanabilmesi için de ön koşul genin anlatım yapması ve bir protein ürün meydana getirmesi. Ek olarak, sentez edilen protein konak hücrede daha önce bulunmadığı için (antijen olarak kabul edilen) bu proteinin saptanabilmesi için özel antikorlar gerekli

Seleksiyon  Yöntemleri 3. NÜKLEİK ASİT MELEZLEME YÖNTEMLERİ Konak hücrelerden rekombinant DNA’yı alanların doğrudan bu DNA moleküllerinin varlığının saptanmasıyla seçilmesi. Yöntemin moleküler düzeyde temeli tamamlayıcı özellikteki nükleik asit molekülü zincirleri arasında melez moleküller oluşması. Seleksiyon doğrudan geni taşıyan DNA parçasının varlığının saptanmasına yönelik (fiziksel yöntem) Bu amaçla “prob” (sonda) olarak adlandırılan, aranılan nükleik asit dizisinin kısmen ya da tamamen tamamlayıcısı olan polinükleotidlerden yararlanılır. DNA veya RNA yapısında olabilen problar radyoaktiviteyle ya da başka yollarla işaretlenir.

Klonlama  Stratejileri  ve  Kitaplık   Oluşturulması Kitaplık (Banka) Bir organizmadaki DNA dizilerinin tümünü ya da bir kısmını içeren DNA klonları topluluğu.

Genom  Kitaplıkları  Kurulması “Shotgun” (rastgele) klonlama (Hogness) Bir organizmaya ait genom DNA ’ sının (genellikle restriksiyon enzimleri uygulamasıyla) çeşitli boylarda parçalara ayrılması, bu parçaların uygun bir vektöre bağlanarak konak hücrelere sokulmasıyla elde edilen klon takımı ⇒ genom kitaplığı (bankası). Genom kitaplığında o organizmanın genomunun hemen tüm parçaları bulunur.

Genom  Kitaplıkları  Kurulması Klonlama sırasında, ön seleksiyon ve herhangi bir dizinin frekansının artırılması için zenginleştirme işlemi yapılmadan genoma ait tüm parçaların klonlanması ⇒ “shotgun” klonlama. Yapılabilecek ön seleksiyon, sukroz gradienti santrifüjlemesi ya da jel elektroforezi gibi tekniklerle DNA parçalarında boy saptaması ve bir genin sığamayacağı kadar küçük ya da vektöre bağlanamayacak kadar büyük parçaların devre dışı bırakılması. Esas seleksiyon son aşamada, transformasyona uğratılan hücrelerde yapılır. Shotgun klonlamanın önemi, binlerce (hatta milyonlarca) farklı nukleotid dizisinden oluşan bir koleksiyondan bir genin izole edilebilmesine olanak vermesi. ⇒ Bir organizmanın uygun bir konakta kurulmuş genom kitaplığı o organizmanın tüm genlerinin araştırılması için devamlı bir kaynak !!!

Genom  Kitaplıkları  Kurulması Her vektör molekülü yabancı DNA ’ nın küçük bir parçasını taşıyabileceği için, genom kitaplığı kurulurken mümkün olabilecek en az sayıda klonda tüm dizilerin taşınmasını sağlayacak vektör kullanımına dikkat edilmesi gerekir. Bir genomdaki tüm dizileri içermek için gerekli klon sayısı klonlanan DNA parçalarının ortalama boyuna ve klonlanan genomun boyuna bağlıdır..

• Cosmid  vektörü  ile  DNA   klonlama

Hücreye  transferinin  kontrolü

Ampicillin  +  X-­Gal  media Ampicillin  media

II.  Hücre  düzeyinde  klonlama III.  Organizma  /çekirdek   düzeyinde  klonlama

Kopyalama  işlemi; •Embriyonik dönemde bir kök hücre (Embriyo kopyalama olasılığı) •Farklılaşmasını tamamen tamamlamış bir vücut hücresi kullanılarak yapılabilir. Böylece yetişkin bir organizmadan alınan hücre kullanılarak yetişkin bir organizma kopyalanabilir.

Nükleer  Transplantasyon Wilmut ve arkadaşları; donör hücre olarak 6 yaşında sağlıklı bir koyunun meme epitel hücresi ve resipient (alıcı) hücre olarak ise aynı koyunun metafaz II evresinde bekletilmiş yumurta hücresi kullandılar. Klonlama sonrası elde edilen ve annesiyle %100 aynı genotip ve fenotipte olan sağlıklı kuzuya DOLLY adını verdiler.

DOLLY

Nükleer  Klonlamanın  Önemi 8 Yumurta hücresinin embriyogeneziste spermden farklı artı (+) öneminin olduğu, 8 Ökaryotik hücrenin G0 evresinde totipotent kromatin organizasyonu kazandıği, 8 Metafaz II evresinde yumurta hücresinin klonlama için en uygun faz olduğu, 8 Memelilerde eşeysiz üremenin mümkün olduğu, 8 Bir gen yerine çekirdeğin tamamının transplante olabileceği gösterildi.

Klonlama Sonrasında; 8 Unipotent  hücrenin  totipotent  hücreye  dönüştürülmesi, 8 Sinir  hücrelerinin  rejenerasyonu, 8 Telomerlerde  ” end  replication  problem”giderilerek,   yaşlanmanın  geciktirilmesi, 8 Stem  (kök)  hücrelerinden  spesifik  doku  eldesi, 8 Epigenetik  modifikasyon  ile  kanser  tedavisine    yeni  bir   yaklaşım, 8“Ex  vivo gene  replacement” ile  genetik  tedavi  ve 8 İnsan  genom  projesi  önemli  bir  ivme  kazanmıştır.